1、济渎红蒜茎尖脱毒快繁培养技术研究摘 要：以济源名优大蒜品种济渎红蒜为研究材料，1/2 MS 为基本培养基，研究了济渎红蒜茎尖脱毒快繁技术。研究结果表明，最优的诱导愈伤培养基为 1/2 MS+6-BA 1.8 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.6 mg/L;分化增殖培养基为 1/2 MS+6-BA 2.6 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L+NAA 1.5 mg/L;生根培养基为 1/2 MS+6-BA 2.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L。 关键词：济渎红蒜;茎尖培养;脱毒;快繁 大蒜作为一种特殊蔬菜，不仅含有丰富的维生素、氨基酸、矿质元素等营养成分，而且含有特殊的
2、抗菌、抗癌等活性物质，被认为是重要的天然保健品1，2。济渎红蒜是济源市地方特色品种，味道辛辣鲜美、蒜薹短粗肥嫩无梗丝、蒜泥味道长久，其独特的品质深受济源人喜爱。济渎红蒜蒜皮紫红透明、光泽喜人，在清朝时作为贡品，只有皇族才能享用，因此又被称为“济渎金蒜” 。近年来，由于病毒病的为害，我国大蒜种性普遍退化、单产降低、品质变劣，一些名优特种大蒜因受病毒病为害几乎濒于绝种3，4。本试验以济渎红蒜为材料，以期筛选出适合其脱毒快繁的培养基，建立一套适宜济源市名优大蒜地方品种脱毒快繁的技术。 1 材料与方法 1.1 试验材料 济渎红蒜，由济源市农科院种植培育。 1.2 试验方法 剥离茎尖时间的筛选 2014
3、 年 5 月底收获济渎红蒜，从收获初开始，每月进行 12 次茎尖剥离试验。 外植体处理 选择生长良好的济渎红蒜流水冲洗 5 h，用洗洁精冲洗数次后，用手术刀片切除 2/3 留基部备用。无菌操作下 75%酒精消毒35 s无菌水冲洗 1 次0.1%氯化汞灭菌 10 min 无菌水冲洗 8 次进行材料表面灭菌。然后用无菌滤纸吸干水分，在显微镜下剥离茎尖，茎尖长度为 0.20.6 mm， 以备接种。 愈伤组织诱导培养基配方的筛选 以 1/2 MS 培养基为基础培养基，设 6-BA、2，4-D、NAA 3 个因素，每个因素 3 个水平，详见表 1，共 9 个处理，详见表 2，每处理 3 次重复。培养基
4、pH 值 6.0、蔗糖浓度为 30%、琼脂粉含量 3 g/L。将剥离好的茎尖接种在不同培养基上，散射光光照强度 2 0003 000 lx、温度（252）、光照时间 12 h/d 进行培养。 分化增殖培养基的筛选 以 1/2 MS 培养基为基础培养基，加入不同浓度的 6-BA、NAA、 2，4-D，共 6 个处理，详见表 3，每处理 4 次重复;培养基 pH 值6.0、蔗糖浓度 30%、琼脂粉含量 3 g/L。将诱导的愈伤组织接种在不同培养基上，培养条件同。 生根培养基的筛选和移栽 以 1/2 MS 培养基为基础培养基，加入不同浓度 6-BA、NAA，详见表 4，共 4 个处理;将增殖济渎红蒜
5、苗接种于生根培养基上，观察生根情况;培养条件同。将生根后的脱毒苗，移栽到已灭菌的草炭蛭石=21 的穴盘中。移栽后覆盖遮阳网防晒、防虫网防蚜虫。 大蒜内病毒的检测 将剥离的大蒜茎尖培养 2 个月后，取部分愈伤或小苗捣碎、研磨，制成组织汁液，用磷酸盐缓冲液在 3 000 r/min离心 20 min 后，在电镜下观察，并以未脱毒的样品作对照，确认含病毒的基本形态和特征。 2 结果与分析 2.1 不同时间对济渎红蒜茎尖剥离的影响 根据每月剥离的情况发现，每年的 5 月底到翌年 2 月底，茎尖容易剥离，并且 810 月剥离的茎尖诱导成活率高于其他时间。因为初期剥离的茎尖，茎尖含水量大，剥离过程中易破碎
6、;而后期，茎尖较小，不易剥离。 2.2 济渎红蒜愈伤组织诱导培养基的筛选 为了促进茎尖成活以及分化，需选择合适的激素配比。试验观察发现，如果在接种后 14 d，茎尖出现透明状，说明在诱导愈伤过程中出现玻璃化现象，且培养基湿度大;接种 20 d 后，茎尖泛绿色，并且膨大，说明开始诱导愈伤。正常的愈伤组织是黄绿色，且结构较为紧密，这种愈伤组织分生能力强，芽点较多;若为深绿色，则太硬不易分化，且最后容易转变为浅黄色而死亡。由表 2 可知，1/2 MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.8 mg/L 的培养基愈伤组织诱导率较高，但愈伤组织呈浅黄色，不分化、不成块，在
7、培养过程中逐渐玻璃化死亡。因此，最佳的诱导培养基为 1/2 MS+6-BA 1.8 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+NAA 0.6 mg/L。 2.3 济渎红蒜分化增殖培养基的筛选 选择较好的愈伤组织进行分化增殖培养，在激素浓度较高的条件下，诱导增殖率会降低，主要表现为形成畸形苗、叶片较长，芽尖生长较慢;有些会出现芽点较多、较绿，而分化比较少的情况。从表 3 可以看出，1/2 MS+6-BA 2.6 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L+NAA 1.5 mg/L，增殖系数可达4 倍，出苗比较整齐，分化苗生长比较健壮。 2.4 济渎红蒜生根培养基的筛选 从表 4 可以看出，1/2 MS
8、+6-BA 2.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L，生根效果最好。6-BA 浓度为 2.2 mg/L 的培养基中，生根少且较慢，出现根部膨大的现象，影响移栽成活率。 2.5 病毒检测结果 随机取再生大蒜幼苗 50 株，用未经脱毒的大蒜幼苗作对照，进行检测。结果发现，对照 100%含病毒，且病毒含量很高;而再生的大蒜幼苗有68%不含病毒，即脱去病毒;15%的病毒含量高，但仍低于对照。说明茎尖剥离脱毒可降低病毒含量。 3 讨论与结论 有资料显示，切取蒜瓣内幼芽的茎尖分生组织，经组织培养获得脱毒苗是解决大蒜品种退化、提高大蒜产量和质量的有效途径57。茎尖剥离过程中，其大小直接影响脱毒效果及成活率
9、。试验中发现，0.30.5 mm 长的茎尖有利于提高成活率并且脱毒效果比较明显;虽然0.10.2 mm 的茎尖脱毒效果最好，但是接种后成活率不高;而茎尖长度低于 0.4 mm 时，诱导愈伤时玻璃化现象严重，原因有待进一步分析。但在脱毒过程中，完全脱毒的成功率还不是很高，下一步需要改进脱毒方法。 参考文献 1 管正学，王建立，张学予.我国大蒜资源及其开发利用研究J.自然资源，1994（5）：54-59. 2 廉洁燮，金今松，马英金，等.大蒜的应用价值及其产品J.延边农学院学报，1990（4）：74-80. 3 张寒霜.大蒜茎尖脱毒培养及快繁技术研究J.华北农学报，2006，21（B11）：117-119. 4 栾非时.脱毒大蒜花原始体培养增殖技术的研究J.中国蔬菜，1995（3）：4-6. 5 高山林，金雍安，蔡朝晖.大蒜分生组织培养脱病毒和快速繁殖技术J.植物资源与环境学报，2000，9（3）：15-18. 6 郑晓峰，黄刚.麻江红蒜茎尖组织培养及快繁技术研究J.长江蔬菜，2008（24）：16-17. 7 刘德军.大蒜药用动植物种养加工M.北京：中国中医药出版社，2001：55-56.
