1、1嘉峪关魏晋墓腐蚀壁画真菌群落组成分析内容摘要：微生物腐蚀与降解是嘉峪关魏晋墓砖壁画保存过程中所面临的主要问题之一。本研究采用现代分子生物学技术，对造成魏晋墓砖壁画腐蚀的真菌类群进行了检测和分析。通过样品总 DNA 提取，目标片段扩增，克隆文库构建，序列测定与比对后发现，魏晋墓腐蚀砖壁画真菌序列主要隶属于曲霉属、Phialosimplex 属和侧齿霉属。常年受人为扰动，墓室内腐蚀砖壁画真菌多样性下降，群落结构发生改变。墓室常年开放或常年关闭均不利于砖壁画的长久保存。分子技术在快速、准确检测壁画微生物群落组成方面优势明显，应加以推广应用。 关键词：魏晋墓；砖壁画；微生物腐蚀；分子检测；真菌类群；
2、文物保护 中图分类号：K854.3 文献标识码：A 文章编号：1000-4106（2013）01-0060-07 1 引言 关于壁画和历史遗迹表面微生物生态学及其环境保护的研究可以追溯到 20 世纪 50 年代末期。由于不同类型壁画的制作材质和工艺不同，其附存的环境多种多样，因而与它们相关联的生物群落也存在很大差异1-3。已有研究表明，腐蚀壁画微生物主要有以青霉属、曲霉属、枝孢霉属和 Engyodontium 为主的真菌4，以芽孢杆菌属、节杆菌属、微球菌属和假单胞菌为主的细菌5，以念珠藻属、鞘丝藻属和绿球藻属为优2势种属的藻类6，以链霉菌属和诺卡氏菌属为主的放线菌7及壳状地衣8等。这些微生物的
3、生长和代谢不仅会影响壁画的美学价值，而且会造成壁画的结构性损坏9，10。 旅游开放对洞窟环境影响方面的研究是近年来文物保护领域关注的热点。法国拉斯科史前洞穴在 1948 年开始对游客开放，但于 1963 年被迫关闭。究其原因，是游客参观访问改变了洞穴内原有环境，导致不同类型的微生物相继爆发，影响到壁画的色度和结构10。同样，光合细菌和异养微生物的蔓延使得西班牙阿尔塔米拉史前洞穴自 2002 年停止对游客开放，经过一系列环境控制后，岩洞是否可以重新开放尚待进一步的科学评估11。埃及图坦卡门墓经过近 30 年的旅游开放，墓穴壁画保存环境日益恶化，微生物污染问题严重，在近期不得不宣布暂停对游客开放1
4、2。与此同时，许多珍贵的洞窟已经禁止参观并被完全封闭，以期恢复洞窟中原有的生态环境系统13。研究发现，游客的进出对莫高窟洞窟内空气微生物群落的组成和结构影响很大14，15。这些研究成果均表明游客的参观活动对壁画原有保存环境产生了极大的扰动，并对其原本脆弱的生态系统造成了严重的冲击。 近年来，分子生物学检测方法因其敏感性和不依赖于样品中微生物的培养而广受研究者青睐，因其可在短期内得到腐蚀微生物群落组成和结构方面的重要信息16-18。截至目前，国内对腐蚀壁画微生物类群的研究还较少9，对于墓室这种特殊环境下的微生物调查则更少19。本研究利用分子生物学检测技术对被誉为“世界最大的地下画廊”的嘉峪关魏晋
5、壁画墓（六号墓和七号墓）内腐蚀壁画的真菌进行了检测，对腐3蚀壁画的真菌群落组成进行了分析。本研究将为国内开展文物的微生物腐蚀监测提供新的理论依据与技术支撑，有利于墓室环境下微生物腐蚀机理的深入研究和文化遗产的长久保存。 2 样地简介与实验方法 2.1 样地简介 嘉峪关魏晋砖壁画墓位于甘肃嘉峪关市东北 20 公里的新城戈壁滩上，古墓群分布长达 20 多公里。六号墓和七号墓相距约 500 米，发掘于1972-1973 年间。目前六号墓对外开放，七号墓暂未开放参观。前期现状调查发现，两座墓均存在构造砖受压裂缝、破损和脱落，局部颜料层产生起甲、酥碱甚至脱落现象，部分砖壁画表面存在微生物菌斑等病害。 2
6、.2 实验方法： （1）样品采集及总 DNA 提取 在壁画微生物病害区域，用无菌解剖刀刮取少量带有菌斑的砖壁画样品，装入无菌 Eppendorf 管中，用分析天平称取 0.1g，使用PowerSoilTM（MOBIO Laboratories，Solanabeach，CA，USA）DNA 提取试剂盒，根据操作说明完成腐蚀壁画微生物总 DNA 的提取，分装后置于-20保存备用。 （2）目标片段扩增 以总 DNA 为扩增模板，真菌 rRNA 基因内转录间隔区（ITS）扩增选择通用引物 ITS1 和 ITS4 20。反应体系（25l）包括 1U 的 Taq 聚合酶，终浓度为 0.2mM 的 dNTP
7、，2.5l10反应缓冲液，单条引物浓度0.2mM，以及 2.0l 模板（大约含有 10ng DNA） 。扩增程序为：预变性4945min，然后在 94变性 1min，55退火 1min，72延伸 1min，完成 30 个扩增循环，终延伸 7210min。用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小与特异性。 （3）克隆文库构建 使用琼脂糖 DNA 纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。取纯化后产物7ul，与 pGM-T 载体连接，并克隆至 E.coli DH-5 受体菌制备的感受态细胞中（Tiangen Co.， Beijing， China） 。根据蓝白斑筛选平板（LB中 AMP 浓度为 100 g
8、ml-1， X-Gal 为 60g ml-1， IPTG 为 20g ml-1） ，每一转化平板挑取 150-250 个白斑，用 T7-SP6 引物直接扩增验证插入片段大小是否合适。将确定无误后的阳性克隆斑挑至液体 LB 培养基中（含 Amp 12g ml-1）37过夜培养，吸取 1ml 菌液送交测序公司完成序列测定（ShangHai Majorbio Bio-technology Co.， Ltd.） 。 （4）测序及序列比对 测定序列使用 CONTIGEXPRESS 软件进行编辑（Informax， MD， USA） ，使用嵌合体检测系统在线完成嵌合体检测21。所得序列在基因数据库 Gen
9、Bank22中完成比对和相似序列的筛选。利用 BLAST 程序在GenBank 序列数据库中与已知类群真菌的 ITS 基因序列进行比较。 3 实验结果 3.1 克隆文库序列比对 通过构建克隆文库，嘉峪关六、七号墓腐蚀砖壁画上分别得到真菌ITS 序列 138 条和 224 条。六号墓腐蚀砖壁画样品中共得到典型真菌序列3 类，七号墓腐蚀砖壁画样品中共得到真菌序列 14 类。在 NCBI 数据库中5对每类序列进行比对，所得信息如表 1 所示。 3.2 腐蚀砖壁画微生物群落组成 通过对微生物腐蚀砖壁画样品克隆文库中典型序列进行 NCBI 比对，六号墓内所获真菌序列隶属于曲霉属和 Phialosimpl
10、ex 属，其中曲霉属占绝对优势，克隆子数占总克隆数的 75%（图 1） 。 七号墓内所获真菌序列隶属于曲霉属、侧齿霉属、青霉属、枝孢属、白僵菌属和未鉴定不可培养真菌种属，其中曲霉属和侧齿霉属为优势属，克隆子数占总克隆数百分比分别为 35%和 23%。 4 讨论 研究结果表明，六号墓微生物腐蚀砖壁画样品中共得到典型真菌序列 2 类，主要隶属于曲霉属和 Phialosimplex 属，其中曲霉属占绝对优势（75%） 。七号墓微生物腐蚀砖壁画样品中共得到典型真菌序列 14 类，至少隶属于 6 个真菌属，其中曲霉属（35%）和侧齿霉属（23%）为优势属。整体而言，六号墓腐蚀砖壁画克隆文库中所得真菌类型
11、低于七号墓，群落组成相对简单，多样性低。前期研究发现，六号墓腐蚀砖壁画细菌多样性比七号墓低19。造成这种情况的原因可能是六号墓长期对外开放，墓室内外空气流通和交换速率相对较快，不利于多数微生物在壁画砖表面生长、繁殖和蔓延。有研究表明，在有游客参观时，洞窟大小与洞窟空气交换速率具有指数相关性23。七号墓常年关闭，内部环境受外界的扰动相对较小，是墓室内微生物多样性较高的可能原因。20 世纪70 年代中期，七号墓墓室曾发生过洪水的渗入，而洪水本身会将外界丰富的有机质带入寡营养的墓室环境，整个墓室内营养链会发生改变，这6就为不同类型微生物的建殖和生长提供了有利条件24。 由于六、七号壁画墓相距仅 50
12、0 多米，所处地理气候环境非常接近，二者最大的差异是旅游开放与关闭，游客参观可能是导致六号墓砖壁画上微生物群落结构发生改变的根本原因。有研究发现，游客参观时呼出的 CO2 气体、水汽及人体自身产生的挥发性气体等因素是影响魏晋砖壁画色变的主要原因，且水汽是最大的媒体介质25。同时，游客参观也会引起洞穴内微生物群落结构发生改变，拉斯科洞穴内变形菌门微生物已从旅游开放前的 45-50% 增加到 98%26。因游客参观而导致洞窟及墓室壁画遭受微生物侵染的案例已经很多10-13，西班牙天然遗迹Casta？?ar de Ibor 洞穴自 2003 年对外开放后，因游客参观带入碎屑而导致卷枝毛霉和镰刀霉菌大
13、肆爆发18。因此，地下墓室的旅游关闭对维持壁画表面原有生物群落多样性及生态系统稳定性具有重要作用，但长期关闭易造成地下墓室空气交换不良，对墓室壁画保存构成了潜在的威胁。因此，墓室常年开放或常年关闭均不利于砖壁画的长久保存。建议根据墓室内温湿度监测数据，制订墓室打开的时间周期方案，以促使墓室内外空气的交换和流通，确保砖壁画的合理保护。 本研究中，曲霉属、Phialosimplex 属和侧齿霉属为魏晋墓腐蚀砖壁画上的优势属。而在西班牙 La Rabida 修道院，从壁画上分离出的优势真菌主要为枝孢属、侧齿霉属和曲霉属9，这与本研究结果非常接近。在河南密县汉墓壁画上，利用基于培养的方法分离得到的真菌
14、主要有青霉属、拟青霉属和曲霉属27；敦煌莫高窟壁画表面培养分离得到的霉菌包括青霉属、曲霉属、枝孢霉属、链格孢属、根霉属，其中优势菌为7青霉属3；从西安曲江翠竹园西汉墓壁画上分离得到的霉菌主要有青霉属、拟青霉属、曲霉属28；而之前研究表明，嘉峪关壁画墓分离得到的霉菌主要有青霉属、交链孢属、被孢霉属、和曲霉属29。Guglielminetti 等（1994 ）发现，意大利阿西西 St. Damian 修道院湿壁画主要受到了枝孢属、曲霉属、链格孢属、青霉属、和镰刀菌属真菌的侵染30。侧齿霉属（23%）在七号墓壁画上占据一定优势，其在壁画的微生物腐蚀过程中可能发挥着至关重要的作用。Karpovich-
15、Tate 和Rebrikova31通过对俄罗斯波洛夫斯科 Pafnutiyev 修道院壁画表面微生物调查发现，白色侧齿霉菌（Tritirachium album）占到分离微生物的 90%，在斯洛伐克 17 世纪建筑体潮湿墙壁上，也发现了白色侧齿霉菌32。Gorbushina 与 Petersen 通过对德国大量壁画研究后发现，白色侧齿霉菌和球孢枝孢菌是壁画上普遍性存在的真菌33，可以作为壁画被微生物侵蚀的一个判断标准。 NCBI 序列比对发现，与真菌 ITS 克隆文库中序列相似的基因文库序列大多与分离自蚂蚁共生菌、植物内生菌、及动物致病菌相似。大量研究资料表明，古壁画上的真菌与节肢动物有关34
16、。节肢动物与大气微粒是否为本研究中腐蚀壁画微生物的主要传播源尚需进一步研究证实。 由此可见，不论是采用传统的分离鉴定手段，还是现代分子生物学鉴定技术，曲霉属与侧齿霉属在腐蚀壁画微生物类群中均占据着重要地位。本研究中分子检测结果与传统富集分离培养手段所获结果具有一定的差异，这与检测技术本身密切相关。首先，传统的富集培养手段只能得到 1%左右的壁画微生物类群，而可能与壁画色变和老化有关的其他 99%的8微生物难以恢复培养，无法真正体现壁画上生存的微生物多样性35。其次，壁画微生物类群存在时间和空间上的动态变化和演替过程，微环境改变或营养源的变化都会使整个微生物群落结构发生新的变化9。现代分子生物学
17、技术在腐蚀微生物群落的快速、准确检测方面具有传统培养分离手段无可替代的优势，在生物腐蚀机理的深入研究方面也具有良好的应用前景。 5 结论 （1）受旅游参观影响，魏晋六、七号墓壁画上腐蚀真菌群落组成差异明显。 （2）曲霉属、Phialosimplex 属和侧齿霉属为魏晋墓腐蚀壁画上的优势属。 （3）曲霉属、侧齿霉属真菌可以作为壁画受微生物腐蚀状况的指示子。 （4）现代分子生物学技术在腐蚀微生物群落快速、准确检测方面具有良好的应用前景。 致谢：特别感谢嘉峪关新城魏晋墓文管所工作人员在采样过程中给予帮助，感谢敦煌研究院保护研究所保护科学室徐瑞红等在实验过程中给予帮助。 参考文献： 1Dupont J
18、.， Jacquet C.， Dennetire B.， Lacoste S.， Bousta F.， Orial G.， Cruaud C.， Couloux A.， Roquebert M.F. Invasion of the French Paleolithic painted cave of Lascaux by members of the Fusarium solani species complexJ. Mycologia， 92007， 99 （4）：526-533. 2Pepe O.， Sannino L.， Palomba S.， Anastasio M.， Blaiott
19、a G.， Villani F.， Moschetti G. Heterotrophic microorganisms in deteriorated medieval wall paintings in southern Italian churchesJ. Microbiological Research， 2005， 165 （1）：21-32. 3冯清平， 马晓军， 张晓君， 等. 敦煌壁画色变中微生物因素的研究.色变壁画的微生物类群及优势菌的检测J. 微生物学报，1998， 38 （1）： 52-56. 4Guglielminetti M.， De Giuli Morghen C.，
20、 Radaelli A.， Bistoni F.， Carruba G.， Spera G.， Caretta G. Mycological and ultra-structural studies to evaluate biodeterioration of mural paintings.Detection of fungi and mites in frescoes of the monastery of St. Damian in AssisiJ. International Biodeterioration.1994， 32 （3）：269-283. 5Heyrman， J.， M
21、ergaert J.， Denys R.， Swings J. The use of fatty acid methyl ester analysis （FAME） for the identification of heterotrophic bacteria present on three mural paintings showing severe damage by microorganisms.FEMS Microbiology Letters， 1999， 181（1）：55-62. 6Ari？?o X.， Hernandez-Marine M.， Saiz-Jimenez C.
22、 Ctenocladus circinnatus （Chlorophyta） in stuccos from 10archaeological sites of southern SpainJ. Phycologia， 1996， 35 （3）：183-189. 7Abdulla H.， Morshedy H.， Dewedar A.Characteriza- tion of actinomycetes isolated from the indoor air of the church of Saint Katherine Monastery， EgyptJ.Aerobiologia， 20
23、07， 24（1）：35-41. 8Mohammadi P.， Krumbein W.E.Biodeterioration of ancient stone materials from the Persepolis monuments （Iran） J.Aerobiologia， 2007， 24（1）：27-33. 9Ciferri O. Microbial degradation of paintingsJ.Applied and Environmental Microbiology， 1999， 65（3）：879-885. 10Bastian F.， Jurado V.， Novko
24、vA.， Alabouvette C.， Saiz-Jimenez C. The microbiology of Lascaux CaveJ. Microbiology， 2010， 156（3）：644-652. 11Saiz-Jimenez C.， Cuezva S.， Jurado1 V.，Fernandez- Cortes A.， Porca1 E.， Benavente.， Ca？?averas J.C.， Sanchez-Moral S. Paleolithic Art in Peril： Policy and Science Collide at Altamira CaveJ. Science， 2011， 334（6052）：42-43. 12Pitts， M. The Guardian， 17 January 2011， p. G2EB/OL.www.guardian.co.uk/culture/2011/jan/ 17/ttankhamun-tomb-to-close. 13Allemand L.， Bahn， P.G. Best way to protect rock art
