宁夏马铃薯脱毒种薯生产及病毒检测技术.DOC

1、 宁夏 马铃薯脱毒种薯 生产 及 病毒 检测技术 的 现状 和发展途径探究 聂峰杰 1* 张丽 1 宋玉霞 1 张国辉 2 詹红 3 （ 1、 宁夏农业生物技术 重点实验室 ， 宁夏银川 750002； 2、宁夏固原市农科所，宁夏固原 750006； 3、 宁夏马铃薯脱毒种薯繁育中心， 宁夏平吉堡 750024） 摘 要： 病毒病是 马铃薯的重要病害，严重 影响 马铃薯 产量和品质， 造成马铃薯种性退化。因马铃薯是无性繁殖作物，病毒病的防治无有效药剂， 通过 培育脱毒种薯能够 有效 解决 由病毒积累 引起的一系列 问题。本文主要介绍了 国内外 马铃薯脱毒种薯生产的关键技术、病 毒检测方法及其应

2、用 、宁夏马铃薯脱毒种薯生产 和病毒检测 现状 ；讨论了不同病毒检测方法的优缺点 和 应用前景 ， 为 宁夏 马铃薯脱毒种薯生产 及病毒检测 的发展 提出了建议 。 关键词： 马铃薯；脱毒种薯；病毒检测 中图分类号： S-1 文献标识码： A The development way to explore and current situation of potatoes virus-free seed breeding and virus detection technology in Ningxia Nie Feng-jie1 Zhang Li1 Song Yu -xia1 Zhang Gu

3、o-hui2 Zhan Hong3 (1、 Key Lab of Agricultural Biotechnology of Ningxia, Yinchuan , Ningxia750002; 2、 Guyuan Institute of Agricultural Sciences, Guyuan, Ningxia 756000;3、 Ningxia Propagation Center of Virus-free Seed Potatoes, Pingjipu , Ningxia 750024) Abstract: Virus disease can cause declining of

4、the quality and production and sex degradation of Solanum tuberosum L, which is one of the important disease of the S. tuberosum L .Because of asexual reproduction, chemical control is invalid, the most effective way to control virus disease is virus-free seed breeding. This article mainly introduce

5、d the domestic and overseas key technology of potatoes virus-free seed production, the methods and applications of virus detection, the current situation of potatoes virus-free seed breeding and virus detection technology in Ningxia; discussed 基金项目：宁夏农林科学院创新先导项目 NKYJ-13-14 第一作者 、通讯作者 ：聂峰杰，女， 1985 年生

6、， 籍贯甘肃，职称： 研究实习员， 学历：研究生，学位： 硕士，主要从事植物病害综合治理研究。 通信地址：宁 夏银川市黄河东路 590 号宁夏农林科学院农业生物技术研究中心，邮编： 750002， Tel: 0951-6886758， Email:。 收稿日期： 修回日期： the advantages and disadvantages of different methods of virus detection, prospected its application, put forward the suggestions for progress of potatoes virus-f

7、ree seed production and virus detection in Ningxia. Key words: Solanum tuberosum L; potatoes virus-free seed; virus detection 马铃薯 ( Solanum tuberosum L.) 是世界上重要的农作物之一，种植面积仅次于小麦、水稻、玉米和大麦，居世界第 5 位。 病毒病是 马铃薯在生长期 间 的重要病害，植株感染 病毒后 表现 出 卷叶、 花叶和束顶 等 几种类型 ，具体 表现出 叶片失绿 、 顶部叶片变色 、 卷曲坏死、卷缩 、植株 矮小 等症状 ，块茎表现为 龟裂

8、、 变小、变尖、内部网状坏死 等症状 ，严重 影响其种用价值 ，一般 会引起 减产 20-30%，严重时减产 80%以上，病情 随着病毒积累 逐年加重，最后 块茎 失去种用价值。 我国 发现的马铃薯病毒有 7 种：即 X 病毒（ PVX）、 Y 病毒（ PVY）、S 病毒（ PVS）、 卷叶病毒（ PLRV） 、 A 病毒（ PVA）、 皱缩花叶病毒（ PVM）、古巴花叶病毒（ PAMV）， 1 种类病毒：纺锤形块茎类病毒（ PSTVd）。 由于马铃薯系无性繁殖，一旦感染病毒无有效药剂防治，病毒在薯块内不断地积累导致马铃薯品质、产量下降。 经过脱毒处理的马铃薯可以 恢复原品种的 生物学 特性，

9、达到复壮的目的， 因此， 通过 培育脱毒种薯 来预防病毒病， 解决由病毒造成 的损失是目前最快速有效的方法 。 马铃薯是宁夏优势主导产业， 2011 年种植面积达 15 万 hm2，其中脱毒 种 薯 种植 面积占 65%， 是 宁夏种植面积第一大作物。 “ 十二五 ” 期间， 宁夏 将 把 中部干旱带和南部山区建成国家重要马铃薯种薯基地，实现种薯脱毒化率达 90%，种植标准化率达到 75%。现已建成农垦良种繁育中心、西 吉县、海原县、固原市马铃薯改良分中心等 5 个脱毒快繁中心，共建设原种基地 600 多 hm2，生产原种 2 万吨；建设一级种基地 1 万多 hm2，生产一级种 25万吨，马铃

10、薯脱毒原种生产能力达到 1 亿粒 /年。 宁夏 脱毒种薯生产量虽然达到一定规模，但是与国内外相比， 马铃薯脱毒种薯繁育体系起步晚、底子薄、基础弱， 生产中 忽视了脱毒种薯的质量监测 ， 致使 种薯 脱毒率低， 单产水平不高，严重影响宁夏马铃薯种薯产业的发展。因此 ， 进一步加强和引进高效准确的脱毒种薯繁育技术和病毒检测技术，从源头 控制 脱毒种薯生产质量 、 提高生产效益是宁夏马铃薯脱毒种薯生 产中亟待解决的问题 。 1 马铃薯脱毒种薯 繁育 的关键技术 培育脱毒马铃薯 是解决 由 病毒引起马铃薯 种性 退化的主要手段。由于植物茎尖分生区细胞增殖速度比病毒向上运输的速度快， 寄主 体内的 病毒

11、分布 不均匀 ，生长点附近的病毒含量很低， 分生组织内 甚至不含病毒 1。 因此 ， 剥取不含病毒的 茎尖 分生组织 ，进一步 培育 可以获得 无病毒植株 。茎尖脱毒 技术 是 目前 应用最广泛的脱毒方法， 已经 在 马铃薯、 甘蔗 、 甘薯等 30 多种作物 上广泛应用 。 1.1 马铃薯茎尖脱毒 培养 关键技术 选择田间生长健壮、品种特性典型一致的马铃薯植株块茎，自然度过休眠期或人工打破休眠后， 将薯块在室内催芽、消毒；在无菌条件下， 剥离 茎尖分生组织， 接种 培养约 4 个月后，长成试管苗；试管苗经过病毒检测，鉴定出确实不带病毒的脱毒苗 ， 经 过切段快繁 生产脱毒试管苗 。 经过 脱

12、毒 的 马铃薯 既 恢复了原品种的特性，达到了复壮的目的 ， 同时也将真菌和细菌 等 病原物 一 并脱除，在一定时期内，没有病毒、细菌和真菌病害，生活力特别旺盛。 1.1.1 影响茎尖脱毒的因素 1.1.1.1 茎尖大小 由于病毒仅存在于维管系统组织中，只有无维管束的分生组织内无病毒，因此，在 茎尖培养中， 剥取 的茎尖越小， 带 毒 可能性越小 ，但是茎尖的培养成活 率变低，一般要求茎尖长度小于 1mm。 Mellor 等 2的 研究 结果表明 ， PVX 病毒 的脱除与 茎尖大小 相关 ，茎尖越小，病毒 含 量越少，脱毒率就越高，但小的茎尖 在培养过程中 不易成苗 ，影响了脱毒苗的成活率

13、。 1.1.1.2 高温处理 高温处理的原理是病毒衣壳蛋白受热 变性 后 病毒失去活性 ， 由于不同病毒的衣壳蛋白分子结构不同，在 寄主体内正常蛋白的含量、病毒浓度、高温处理时间等外部因素的影响 下 ，不同病毒的抗热能力不同。 Kassanis3研究 发现 ， 将 马铃薯块茎 经过 37.5 高温处理 20d 后 ，部分 卷叶病毒 自然消失 ， 产生了无卷叶 症状的植株 。 部分通过单一茎尖剥离难以脱除的病毒，如 PVX 和 PVS， 经过 高温处理 可显著提高脱毒率。 Morel 等 4研究发现 ， 单一的 茎尖组织培养 对 PVY 和 PVA 的 脱毒 率达 85%90%， 但 对 PVX

14、 和 PVS 的脱毒率却小于 1%， 当 经过热处理 后， 茎尖培养 PVS 的脱毒率提高至 11.4%。 由此证明了热处理能使病毒失活， 如 在茎尖培养之前对 取材 进行 热处理 ， 可 更加 提高脱毒的效果。 1.1.1.3 培养基成分 马铃薯茎尖培养的基础培养基为 MS 培养基 ，适当提高 其中的 铵盐和 钾盐的浓度 有 助于提高茎尖的成活率 5。 因 植物生长调节剂的种 类和浓度直接影响茎尖的生长，加之马铃薯 不同品种对激素反应不同，所使用的激素种类和浓度 要做相应的调整 。此外， 张辅达 6的研究结果表明，在 适宜的培养条件 ， 要 根据 马铃薯茎尖组织在培养过程 中 的 不同 生长

15、发育 类型改变生长调节剂的浓度及处理时间才能提高茎尖成活率 。 培养基中加入 病毒抑制剂 同样 可提高茎尖培养的脱毒 率， Wambugu F.M.等发现 ， 在培养基中加入 20 mg/L 病毒唑 后 ， 89%的 马铃薯茎尖再生植株排除了 PVY， 90%的 再生植株排除了 PVX。 Klein R.E 等 7的研究 也 发现，培养基中加入 10 mg/L 病毒 唑 后， 80%的 马铃薯茎尖 再生植株 除去 了 PVX。 1.1.1.4 培养条件 剥离出的茎尖接种到培养基后 在适宜的温度和光照下才能正常生长 ， 通常 温 度控制在20-25 最为适宜 ， 最适 光照强度 为 2000-3

16、000Lx，光照时间 为 12h/d， 自然散射光照射 下 培养的脱毒试管苗生长 更加 健壮。 1.1.2 马铃薯病毒的脱毒难易程度 马铃薯 不同病毒的脱 除 难易程度不同， 同样大小的茎尖 ， 类病毒 PSTVd 最难脱除，在各 种 病毒中以 PVX 和 PVS 最难脱除 ，常见病毒 脱 除 的难 易 顺序为 PSTVd 、 PVS 、 PVX、PVM 、 PAMV 、 PVY 、 PVA 、 PLRV。 1.2 宁夏马铃薯脱毒种薯生产现状 宁夏 的脱毒种薯 繁育 主要采取 单一的 茎尖剥离、组织培养的方法诱导出试管苗，脱毒试管苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法扩繁基础苗，在防

17、虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（脱毒小薯）。用原原种在自然隔离室网室隔离条件下生产原种，用原种以后逐级生产一级种和二级种。 2 马铃薯 脱毒 种薯 的 病毒 检测 技术 因脱毒培养各个环节存在 误差，经过 脱毒 的 马铃薯 植株 必须经过 严格的 病毒学检测 ， 确定 不带 病毒 后 才能进一步扩繁 。 因此 ，在马铃薯 病 脱毒种薯培育过程中，准确 可靠的病 毒检测 方法 与 高效的 脱毒方法同等重要。 随着 植物病毒分类体系 趋于 完善， 各种 病毒鉴定技术不断 发展 ， 病毒检测 先后经历了 生物学检测 技术 、 免疫学检测 技术 和 分子生物学检测技术 三个阶段 。 2.1 国

18、内外常用的病毒检测方法 2.1.1 生物学 检测技术 生物学检测 技术 主要 通过 寄主植物和病毒的传播方式 、寄主 表现出的 病症 对 植物病毒病进行 诊断 ， 通过测定 病毒寄主范围、 观察鉴别寄主反应，对 病毒 的稀释限点、 钝化温度、体外存活期等离体性状和传播途径 的 测定 来进行病毒种类鉴定 。 指示植物法 是 利用各个病毒不同的症状和传播方式，通过媒介昆虫或摩 擦 将待测植株的汁液 接种在 对病毒敏感的 指示 植物上 ， 观察 指示植物症状确定 待测植株 内有无病毒以及带何种病毒。吴凌娟 8等将病毒接种 指示植物 ，经过 培养对马铃薯 PVX 的寄主范围、症状表现 从形态学角度 进

19、行了研究。 生物学检测技术 不仅可以检测病毒，还可提供病毒形态学上 的 毒力指标 是早期 重要的 检测方法 ， 具有 准确、直观 的特点 ， 但 是某些 特定鉴别寄主不易得到，样品 量大 时 需要大面积的温室 ， 鉴定过程操作 繁冗 ， 所需周期长， 几种病毒复合感染后 会表现不同的症状 ， 环境 不同 指示植物 也 会表现不同的症状 。 因此 ， 不能 作为最终鉴定 结果 ， 也 无法 适应生产 上快速检测的需要 。 2.1.2 免疫 学检测 技术 植物病毒的核蛋白是由蛋白质和核酸组成的一种很好的抗原，抗原与特异性的抗体结合后失去活性的过程叫做免疫反应，也叫做血清反应。 由于不同病毒产生的抗

20、血清特性不同 ，根据血清学原理研究出 了 许多病毒鉴定检测的方法 ， 目前应用 最 广泛的免疫学检测法 是酶联免疫吸附法（ Enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA） 。 胶体金免疫层析检测法（ Gold Immuno chromatography Assay， GICA）是近年来发展起来的一种将金标记代替了 ELISA 中的酶标记的一种快速检测方法，有着广阔的应用前景。 2.1.2.1 酶联免疫吸附法 （ ELISA） 20 世纪 70 年代 初 Clark 等 9报道了 ELISA检测植物病毒的基本方法， 该方法非常灵敏，病毒检出浓度为 10-100

21、ng/mL， 自 此 ELISA 被广泛应用于植物病毒检测中 。 其主要原理是免疫酶法与固相吸附技术相结合， 使酶分子和免疫球蛋白分子 在不影响 其 活性和反应条件下 ， 共价结合 形 成酶标记抗体。酶标记抗体可直接或通过免疫桥与包被在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合， 再通过酶底物作用产生有颜色或电子密度高的 可溶性产物，借以显示出抗体的性质和数量 10。 近年来 ， 在原基础上改进衍生 出 了一些新的 检测 方法，如斑点免疫吸附、伏安酶免疫分析、快速 ELISA 等。 白艳菊等 11分别用快速 DAS-ELISA 法和常规 DAS-ELISA 法检测了 PVX、 PVY、 PVS、

22、 PVM、 PLRV 等五种病毒，比较了两种方法的实用性和准确度。 刘卫平等 12采用快速 ELISA 法检测了马铃薯 PVX、 PVY 病毒。 ELISA 灵敏度高、特异强、经济简便、易于观察 适合于 大 量样品的 检测 。 ELISA 的缺点是： 抗体的制备 过程复杂耗时 ； 一次 只能 检测一种病毒， 检测 多种病毒时灵敏度 和准确率降低 ； 检测病毒时 会出现 假阳性反应， 准确性 降低 ； 病毒 浓度低当年不显症 时 ， 无法 检测；无法检 测 类病毒。 2.1.2.2 免疫胶体金技术 （ GICA） 免疫胶体金技术（ GICA）利用抗原抗体结合的免疫学原理， 以胶体金为示踪标志物

23、，有效地 检测病毒抗体，是一种快速、简便、结果容易判定的新型免疫标记技术 ， 已经在马铃薯病毒检测中得到了应用。魏梅生等 13研制了马铃薯 PVX 和 PVY 的胶体金免疫层试纸条，10min 内可检测出病毒，与 ELISA 验证结果吻合。朱云芬 等 14利用免疫试纸条快速检测了马铃 薯 PVY， 并用 RT-PCR 方法验证了试纸条的准确性。 利用 GICA 技术制成的 胶体金试纸条具有以下优点： 试剂和样本用量极小 ， 可低至12L，且 样品 无 需特殊处理 ； 操作简单，不需仪器， 适 用于肉眼水平的免疫检测 ， 适于现场 检测 应用； 敏感性和特异性高，抗原 和 抗体 都可以 检测；

24、检测速度快，几分钟之内就可以得出检测结果 ；实验结果可以长期保存 ， 这使其在马铃薯脱毒种薯的病毒检测上有很大的应用潜力。 2.1.3 分子生物学 检测 技术 由于免疫学检测技术的检测目标是蛋白，仅检测到蛋白不能肯定病毒有无生物活性，而分子生物学检测 目标 是具有 侵染性的核酸，因此 检测结果 较免疫学检测技术 更为可靠。 近年来， 随着分子生物学技术的快速发展， 很多日趋成熟的检测技术已经 应用于马铃薯病毒检测中。 有 专为检测类病毒设计出的 聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）、 核酸杂交 (Nucleic acid h

25、ybridization， NASH)技术 、 医学上病毒检测常用的 指示分子-核酸序列扩增 (Molecular Beacon-Nucleic acid sequence based amplification， NASBA)技术以及 目前应用最广泛的 反转录 -聚合酶链式反应 (Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术等。 2.1.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳法是检测类病毒的重要手段， 其网状结构有分子筛的效应，在电泳过程中可以保持蛋白质的完整状态，根据蛋白质的分子量大小、形状、附带

26、 的电荷呈梯度分开。 Morris 和 Pfannenstiel 为了筛选马铃薯核心种薯建立了检测类病毒的聚丙烯酰胺凝胶电泳法 。 1986 年 ， Schumacher 建立了双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （ R-PAGE） ，利用了类病毒核 酸 在高温条件下迁移、变性变慢的特点，提高了 鉴定准确性。 Singh15、 16利用 R-PAGE法检测区分了休眠薯块中 PSTVd 的弱系、中间系和强系 ，利用该方法检测 PSTVd 弱株系灵敏度达到了核算杂交技术反应的水平。 PAGE 可检测到 800ng 的类病毒，灵敏度较高，在一般试验条件下，只需一套电泳设备 ，操作简便，并可以区分类病毒的强系和

27、弱系，但是一次只能检测十几个样品，不适合大量样品的检测。 2.1.3.1 核酸杂交检测技术 （ NASH） 由于类病毒不具有外壳蛋白， 用 免疫学方法 无法 检测， Owens和 Diener171981年 设计 了核酸杂交检测技术 用于类病毒 PSTVd的检测。 该方法 将一段病毒核酸单链以某种方式加以标记制成探针 ， 与互补的待测样品核酸杂交， 根据互补的核酸单链可以相互结合的原理，带有探针的杂交核酸 能 指示病原的存在。 Querci18用该方法成功的检测了 PVX 不同分离株系。研究发现核酸杂交检 测技术中所用探针越大，灵敏度越高 19。 Yamashita等 20研究表明 NASH灵

28、敏度可以达到 3.25kb的探针检测到 5pgRNA，比 ELISA更灵敏，检测结果更可靠。 NASH较之 ELISA更灵敏，更可靠，更适宜于 检测大量样品 ， 在检测类病毒时灵敏度和精确性高于 PAGE法， 但 是对 探针的分离比较困难 且 检测过程中采用的 同位素标记有放射性污染和安全问题 。 NASH不易检出 休眠种薯中的病毒，尤其 是检测休眠种薯中的 PVY 和PLRV两种病毒 时灵敏度不高 21。 2.1.3.2 指示分子 NASBA 技术 NASBA 技术 是医学上检测 RNA 病毒的主要方法， 适宜于马铃薯病毒的常规检测， 其原理是 以 RNA 转录为基础的等温扩增方法，适用于

29、RNA 分子 扩增， 在有双链 DNA 存在的情况下 也可 实现对单链 RNA 的特异扩增 ， 一般可通过分子杂交判断扩增结果，具有高度的特异性。 Klerks 等 22利用 NASBA 技术检测 马铃薯块茎 上 PVY 和 PLRY 病毒 ，最低检出量为 10g。 NASBA 检测技术不但可以实现病毒的检测，还可以对样品中病毒浓度进行分析，可同时对不同病毒和同种病毒的不同株系进行检测 23，具有检测效率高，特异性好的特点 。 2.1.3.3 RT-PCR 检测技术 RT-PCR 技术 基 于大部分植物病毒、类病毒的 遗传物质 是 RNA， 以 待 检测 病毒 RNA 的全部或部分序列 为基础

30、 ， 设计 合成一对特异性引物 (也可用随机引物 )， 将 待测 RNA 反转录成 cDNA 再进行 PCR 扩增 的反应 。 该 方法可以用于检测 不同 植物感染的 各种病原物，包括真菌、细菌、病毒 、 类病毒、植原体、线虫等 ， 是目前应用最 广泛的 、最有发展前景的病毒检测技术。 自 二十世纪九十年代 起，国内外 相继用 RT-PCR 方法 检测 了多种马铃薯病毒 （类病毒） 24-26。 多重 RT-PCR 技术 体系的建立，实现了多种病毒同时检 测， 提高了检测效率的同时 ， 降低了 检测 成本 。 王中康 27根据马铃薯病毒 CP 和 P1 基因序列设计 了 特异性引物对 ，建立了

31、 可以同时检测 PVX、 PVS、 PVY、 PLRV 和 PVA 的 多重 RT-PCR 快速检测体系 ，灵敏度比 ELISA 提 高 至少 100 倍。 董代幸 28根据 PVX、 PVY、 PVA、 PLRV 的 CP 基因序列设计了 4 对特异性引物，建立了能够同时检测这四种病毒的一步多重 RT-PCR 检测方法。 RT-PCR 检测技术 灵敏度高，特异性强 ， 在基因水平上 仅用 微量 植物 感病组织液即检测出含量极低的病毒 RNA。 同时 作为病毒鉴定的重要依 据， 该方法 可以 结合 核酸序列分析基因序列 中 的分子变异， 检测 不同 病毒株系间的序列同源性，比较 其 亲缘关系

32、。多重 RT-PCR分子检测技术的建立，可以同时检测多种病毒，降低检测成本，简化 操作 程序， 进一步推进了该方法的广泛应用 。 2.2 宁夏马铃薯脱毒种薯病毒检测现状 宁夏马铃薯脱毒种薯生产中的 病毒检测主要采用 生物学检测技术中的 指示植物鉴定 、免疫学检测技术中的 酶联免疫吸附试验法 （ ELISA） 、 分子生物学检测技术中的 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 鉴定 马铃薯多种病毒及类病毒，经鉴定无主要病毒及类病毒的试管苗可定为脱毒试管苗。 3 结语 脱毒种薯的推广种植可有效地提高 马铃薯 的 产量和品质。 茎尖 分生组织 培养脱毒 试管苗在马铃薯脱毒种薯生产中已经取 得了长足的发展，但是

33、宁夏的马铃薯脱毒生产 在实际操作中人工剥离茎尖存在一定误差，这 为种薯产业化种植留下一定的隐患 ，有必要 在脱毒过程中 结合其他方法 探寻 更 加 快速，有效，便于 大规模生产的脱毒方法。 本文 总结归纳 了 国内外 马铃薯病毒检测的 常用方法，每种方法 根据原理和检测目标不同， 都有其各自的优缺点 。 其中， RT-PCR 法特异性强，准确率高， 随着相关 技术、 仪器的普及推广， 其应用 范围必将越来越广泛 。 GICA 法操作简 便，快速准确，适宜于现场快速检测，具有很好的应用前景。 宁夏 目前采用的病毒检测 方法在实际操作过程中存在灵敏度低、所需时间长，费时费力、不经济实用等弊端 ，而

34、一些快速高效的检测方法还未在我区的脱毒马铃薯检测工作中开展。 因此有 必 要 根据 宁夏 马铃薯脱毒 生产中 待测 病毒类型、技术掌握程度、设备条件 、检测目的和要求， 将传统生物学技术、免疫学检测技术和分子生物学技术 因地适宜 地、 有机地 结合 起来 ， 形成一套完善的高精度、高标准、规范化的脱毒种薯质量检测体系，为指导 宁夏 马铃薯产业的快速、健康发展提供技术支撑。 参考文献： 1 胡 琳 .植物脱毒技术 M.北京 :中国农业大学出版社 ,2000,1-2. 2 Mellor F.C., Stace -Smith. Applied and fundamental aspects of p

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