1、生殖与发育毒性,主讲教师 陈华,生殖过程也称繁殖过程 生殖细胞的发生形成 交配 受精 合子形成 着床 胚胎形成及发育 分娩 哺乳,外源化学物对生殖发育的影响,干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴) 途径作用于生殖发育过程 。,生殖毒性和发育毒性常用的术语,1、生殖毒理学(reproductive toxicology)主要研究外源化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用及其评定，评定方法即为生殖毒性试验（繁殖试验）。2、
2、发育毒理学(developmental toxicology)主要研究外源化学物对胚胎发生、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响及其评定，评定方法称为发育毒性试验，主要为致畸试验。,生殖毒性和发育毒性常用的术语,3、胚胎毒性 指化学物对胚胎的选择毒 性作用。4、胚胎毒物 具有胚胎毒性的物质。5、致畸性 指胚胎在器官发育期接触化 学物后，造成永久性结构或 功能畸形。,6、致畸剂 具有致畸性并使出生缺陷发生率明显增加的物质。7、母体毒性 指对怀孕动物的毒性效应。8、发育毒性（developmental toxicity）指出生前后接触外源性理化因素引起的在子代发育为成体之前出现的任何对发育有害的表现，包
3、括：结构畸形，生长迟缓，功能缺陷及死亡。发育毒物（developmental toxicant）能造成发育毒性的物质称为发育毒物。通常指在未诱发母体毒性的剂量下产生发育毒性的物质。,9、出生缺陷（birth defect） 是指婴儿出生前即已形成的发育障碍，包括形态结构异常（畸形）和功能缺陷（如智力低下，代谢和行为的异常）。10、不良妊娠结局（adverse pregnancy outcome） 包括子代所有的不良结果：流产、死胎、死产、宫内生长迟缓、发育异常、新生儿和婴幼儿期死亡等。,生殖毒性,外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为性淡漠，性无能或各种形式的性功能减退。雌性可出现排卵规律
4、改变，月经失调或失经，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎缩或坏死，精子数目减少。,男性生殖毒性,毒物可影响 精子的产生 精子输送 神经系统 内分泌系统,精子的产生过程,特定靶位睾丸内环境 与精子快速生成过程有关的细胞分裂和代谢活性，对某些类型的损伤特别敏感。 化学物特别容易损害DNA或影响快速生长组织需要的细胞蛋白功能或细胞呼吸。 DNA损害 蛋白质损伤,下丘脑-垂体-性腺轴激素调节,下丘脑-垂体-性腺轴 雄激素 黄体生成素（LH） 促性腺激素释放激素（GnRH）,女性生殖毒性,女性生殖系统的功能,卵细胞毒性 阻滞原始卵母细胞，影响进一步的成熟和排卵。
5、如抗癌药-白消安。卵巢体细胞和生殖道毒性 卵巢体萎缩环氧树脂、呋喃妥因 输卵管和子宫萎缩镉,女性生殖功能激素调节和相关毒性,下丘脑-垂体-性腺轴 促性腺激素释放激素 （GnRH） 黄体生成素LH 促卵泡素FSH 雌激素 孕激素,生殖毒性的评价,外源化学物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。生殖毒性试验可以全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响。,生殖毒性的评价,评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况
6、等。,生殖毒性的评价,试验方法原则受试动物：性成熟大鼠、小鼠或家兔剂量分组:一般设立三个剂量组（至少两个剂量组）和一个对照组染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径,生殖毒性的评价,动物数:每组雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只给药物时间：雄性交配前60天开始给药，连续60天；雌性交配前14天给药，连续14天。观察交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。,两代一窝(和一代一窝)生殖试验,繁殖试验,观察指标,受孕率（）:反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况正常分娩率（
7、）:反映雌性动物妊娠过程是否受到影响幼仔出生存活率（）:反映雌性动物分娩过程是否正常幼仔哺育成活率（）:反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力除上述个指标外，还应该注意出生幼仔是否有畸形存在，对死亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一步致畸试验提供参考,发育毒理学,发育毒理学（deve1opmenta1 toxico1ogy）是研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的发育过程中，由于出生前接触导致异常发育的理化因素或环境条件后的发病机制（pathogenesis），和结果的学科。是毒理学的重要分支学科。,畸胎学,最早可以追溯到6500 D.B.。古希腊的名医希波克拉底和亚里斯多德认为异常的发育可
8、以被子宫内的创伤或应激的物理因素引起，母体的印象和情绪可以影响儿童的发育。随着十六、十七世纪生物科学的兴旺发展，William Harvey于1651年提出了畸形起因于器官或结构的不完全发育的发育障碍学说，认为可解释除遗传起源以外的所有畸形。,现代实验畸胎学,现代实验畸胎学开始于十九世纪初，许多十九和二十世纪的胚胎学家，使用各种不同的物理（震动，倒置，针刺）和化学因素处理鸡蛋，产生了畸形小鸡，有神经管缺陷、无脑畸型、脊柱裂，独眼畸型，心脏缺陷，位置颠倒和联体双胞胎。重要的是，他们注意到作用时间在决定畸形类型方面比损伤的性质更重要。,发育毒理学,1935年，Hale第一次报道，维生素A缺乏诱导哺
9、乳动物母猪产下包括突眼和颚裂的畸形后代。之后，许多饮食、环境因素（化学和物理因素），如：氮芥，锥蓝，激素，抗代谢物，烷化剂，缺氧和x光的致畸作用被研究。 1941年，Gregg报告了母亲风疹病毒感染在奥地利导致眼睛，心脏和耳缺陷以及智力发育延迟的发病率增加，并分析了与感染时间的关系。,发育毒理学,19611962年，西德的儿科病房中出现了大量罕见的短肢畸形儿，多数为四肢缺陷、无眼、腭裂、骨骼发育不全，十二指肠和肛门闭锁。同一时期，全球出现了5850个短肢畸形儿。McBride和Lenz在德国和澳洲的独立研究，均确认反应停是其原因。反应停事件是人类历史上的一个悲剧。但由此，促进了化学致畸的研究以
10、及管理法规的建立。1966年美国FDA提出了三段生殖毒性试验指南，包括了对致畸等发育毒性的评价。,短肢畸形儿,短肢畸形儿,人类不良生殖结局：,着床后的丢失（流产和死胎）估计为31 %；自发单一畸形大约10；严重畸形的总率在出生时约有23 %，到1岁时约67 %；出生缺陷有14 %；低出生体重7 %；l岁之前婴儿死亡率1.4 %；神经功能异常占1617 %；人类正常生育率只有50 %左右。,发育各阶段发育毒性作用的特点,1.着床前期 又称分化前期，从受精时算起，到完成着床之前。其期限在人类为d11d12；啮齿动物为前6d。受损的是相对未分化细胞，致胚泡死亡称为着床前丢失（preimplantat
11、ion loss）。一般认为，此时很少发生特异的致畸效应。,发育各阶段发育毒性作用的特点,2.器官形成期 着床后孕体即进入器官形成期，直到硬腭闭合。人是3周8周。一般认为大鼠、小鼠、兔的着床时间为妊娠d6d7天，硬腭闭合时间为妊娠d15d18。器官形成期特别容易感受致畸物的作用而诱发器官结构的缺陷，即结构畸形，故又称为致畸敏感期或致畸作用危险期（critical period）。此期以结构畸形最突出，也可有胚胎死亡、生长迟缓。,人胚胎主要器官的致畸敏感期,妊娠3周时的胚胎,妊娠6周时的胚胎,发育各阶段发育毒性作用的特点,3.胎儿期 器官形成结束（以硬腭闭合为标志）后即进入胎儿期（人类从d56d
12、58起），直到分娩。在胎儿期接触发育毒物不良作用主要表现为：全身生长迟缓、特异的功能障碍、经胎盘致癌和偶见死胎。 免疫系统、中枢神经系统和生殖器官的功能异常，包括行为的，精神的，运动的缺陷和生殖力降低等。这些临床表现需要出生后对子代的仔细观察和测试才能发现。,妊娠11周时的胎儿,妊娠18周时的胎儿,发育各阶段发育毒性作用的特点,4.围生期和出生后的发育期 围生期从第二十六周至出生后4周，出生后的发育期 指出生后5周至成体。围生期是一生中对致癌物最敏感的时期，许多儿童期高发的肿瘤（急性淋巴细胞性白血病、神经母细胞瘤、骶骨前畸胎瘤、胚性腺肌瘤等）都可能与出生前因素有关。妊娠期或围生期接触外源化学物
13、，会严重影响出生后T细胞、B细胞和吞噬细胞的发育、迁移、归巢和功能。 出生前后接触具有发育神经毒性的化学物，表现为对感觉、运动、自主和认知的影响。,出生后,发育毒性的剂量-反应模式和阈值的概念,三 发育毒性剂量-反应（效应）关系十分复杂，并且因化学物的类型，暴露的时间和剂量而改变。致畸带 指从NOAEL到胚胎死亡剂量之间的剂量范围。,发育毒性的剂量-反应模式,主要有以下三类：1.除了在较高剂量几乎全窝胚胎死亡外，正常胎、生长迟缓和结构畸形同时存在。 2.在远低于胚胎致死剂量下即可出现致畸，甚至全窝致畸。3.有生长迟缓和胚胎致死但没有畸形发生。,阈值,哺乳动物的发育毒性通常被认为是一种阈值现象。
14、假定的阈值是低于它有害的反应不会发生的母体的剂量。但是，发育毒性是否有阈值还有争论。 是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。,发育毒性的物种差异,物种差异以及个体差异在致畸作用中较为明显。同一物质在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。种间差异即同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。,母体毒性（materna1 toxicity）与发育毒性,母体毒性 是指化学毒物对孕母产生的损伤作用，表现为增重减慢、功能异常、临床症状，甚至死亡。目前常常用增重减慢和死亡率来表示。发育毒性可能是直接对孕体的效应或间接通过对母体及胎盘的毒性，以及直接、
15、间接效应的组合毒性。,母体毒性与胚胎毒性的关系,具有发育毒性，但无母体毒性。表示致畸作用有特定的机理，与母体毒性无关。如反应停。这类化学物最容易被忽视也最危险。出现发育毒性也出现母体毒性：尤其是当发育毒性只在母体毒性存在时才能被观察到的时候，发育效应可能是间接的，往往不具有特定的致畸机理。如乙醇和可卡因，主要在母体毒性水平对胚胎/胎儿有有害影响，他们的发育毒性可能部份归咎于母体生理学的紊乱的继发效应。,母体毒性与胚胎毒性的关系,具有母体毒性，但不具有致畸作用：这类物质在妊娠期很容易引警觉，避而远之。在一定剂量下，既无母体毒性，也不表现发育毒性。,致畸（发育毒性）作用机制,1.基因突变与染色体畸
16、变 2.干扰基因表达3.细胞损伤和死亡4.干扰细胞-细胞交互作用 5.通过胎盘毒性引起发育毒性 6.干扰母体稳态,发育毒性和致畸作用试验与评价,一 动物发育毒性试验已为国际接受的试验程序生殖毒性的ICH三阶段实验指南。提供了动物种/系选择，给药途径，剂量水平，给药次数和间隔，暴露期间，实验的样本大小，观察技术，统计分析和报告要求的指南。,发育毒性和致畸作用试验与评价,三阶段试验：I阶段试验：检测对生殖能力、早期胚胎发育的影响（一般生殖毒性试验）；染毒 雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性着床期间；观察 受试物对成年雌雄性的生殖功能、配子的发生及成熟、交配行为、受精、着床前的发育和着床的影响。,受
17、精过程,发育毒性和致畸作用试验与评价,II阶段试验：检测对胚胎和胎儿发育的影响（致畸试验） ；染毒 从着床-硬腭闭合期间；观察 受试物对成年雌性生殖功能、胚胎发育、器官形成期的发育毒性。,致畸试验,动物选择: 致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。多选择小鼠或大鼠。,致畸试验,剂量分组一般应先进行预试，目的是找出引起母体中毒的剂量。最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不
18、超过10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。一般最高剂量不超过LD50的1/51/3，低剂量可为1100130。,致畸试验,动物交配处理每组动物大鼠或小鼠为1220只，家兔812只，狗等大动物34只。性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。,致畸试验,胎仔检查自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎
19、及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。,致畸试验,下列几方面进行畸形检查：外观畸形肉眼检查，例如露脑；肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。,致畸试验,结果评定活产幼仔平均畸形出现数:即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。畸形出现率:即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。母体畸胎出现率 :即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。,致畸试验,确定受试物是否具有致畸作用时需注意以下几点：任何结果必须通过统计计算方法进行剂量组与对照组对比；必须具有统计学意义才能认为
20、是阳性结果.应该掌握所用实验动物品系的自然畸形发生率。致畸作用中动物物种和品系差异较为显著，因此要求在两种动物进行试验。由于物种差异，对动物不具有致畸作用的外源化学物对人是否致畸的问题，应格外认真对待。,发育毒性和致畸作用试验与评价,III阶段试验：检测对出生前后及哺乳期发育的影响（围生期毒性试验）；染毒 孕母从着床到幼仔断乳期间；观察 从着床到子代性成熟的母体生殖毒性（成年雌性生殖功能：妊娠、分娩和哺乳）和子代的发育毒性（胚胎、胎儿生长发育，新生幼仔宫外生活的适应性，断乳前后的生长发育，独立生活能力和成熟的性功能）。,发育毒性和致畸作用试验与评价,二 流行病学研究和人类的证据可以用流行病学方
21、法来研究环境发育毒物对人类发育的影响，包括其性质、程度以及原因。 要发现危险的增加，需要正确发现异常结局和暴露，需要足够大的效应和研究人群。病例报告和出生缺陷监测登记对获得对人类的发育毒性证据是有用的。,发育毒性和致畸作用试验与评价,美国FDA(l979)对于药物在妊娠期的使用用字母A，B，C，D和X来进行等级评定 A类表示，在妊娠人群中控制良好的研究未能证实有危险。X类表示在妊娠期用药是不当的。 C类，表示危险不能够被排除。 B和D分别代表与危险的关系相对地较小，或较大。,Wilson 曾提出确认人类新的致畸物的标准：,1.某种特异的缺陷或几种缺陷综合症的发病率突然增加； 2.缺陷的增加与某种已知的环境改变，如某种新药的广泛使用巧合； 3.已知在妊娠的特殊阶段接触环境的改变，产生有特征性的缺陷综合征； 4.缺少妊娠时引起特征性缺陷婴儿产生的其他普通因子。,发育毒性和致畸作用试验与评价,三、发育毒性的替代试验 1大鼠全胚胎培养（who1e embryo cu1ture， WEC） 2胚胎细胞微团培养（micromass culture） 3. 小鼠胚胎干细胞试验（the mouse embryonic stem cell test， EST） 4. 发育毒性的体内预筛试验（C.K试验）,Thank You,
