1、本 科 毕 业 设 计（论文）题 目：煤层环境中微生物群落结构及其增产煤层气作用机理研究学生姓名： 学 号： 专业班级：材料物理 指导教师： 20XX 年 6 月 16 日中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文）煤层环境中微生物群落结构及其增产煤层气作用机理研究摘 要本文从微生物群落结构分析、煤层气增产效果分析以及微生物对煤组分和结构的影响三方面研究了微生物增产煤层气的作用机理。首先采用高通量测序技术分析了煤层环境中菌群种类和丰度；其次采用气相色谱法和气体同位素判定法分析了煤层气的组分和种类；最后采用元素分析法、红外光谱法、X 射线衍射法和压汞法分别研究了微生物对煤样元素的种类和含量、官能团种
2、类、微晶结构和孔隙率的影响。研究结果表明，煤层微生物中的优势菌种（细菌和古菌）能够产生以甲烷为主的生物成因气，且微生物的代谢作用使煤中碳含量下降、含碳官能团含量下降，孔隙率增大。该研究能够为微生物增产煤层气技术的现场应用提供理论指导。关键词：微生物群落；煤组分；煤结构；生物成因煤层气中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文）The research of microbial community structure and its mechanism of producing coaled methane in coal seamAbstractThis article carried out t
3、he research on mechanism of microorganism producing coaled methane (CBM) in three aspects, including the analysis of microbial community structure, the effect of increasing production of CBM, and the microbial influence of the component and the structure of coal. Firstly using high-throughput sequen
4、cing technology analysed the species and abundance of bacterial communities in the coal seam; Secondly using gas chromatographic and gas isotope determination method analysed composition and species of CBM, respectively; Finally this article adopted Elemental Analysis, Infrared Spectrometer (IR), X-
5、ray Diffraction (XRD) and Mercury Porosimetry Analysed the microbial effect on the type and content of coal element, the type of functional group, the microcrystalline structure and the porosity. The results showed that, the main bacteria and archaea in coal seam can produce biogas which is mainly c
6、omposed of methane, and microbial metabolism decreased carbon functional group levels and increased the porosity of coal seam. The study can provide a theoretical guidance for the field application of microorganism producing CBM technology.Keywords: Microbial communities；Coal composition ；Coal struc
7、ture；Biogenic coalbed methane中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文）目 录第 1 章 前言. 11.1微生物增产煤层气概述 . 11.1.1 微生物增产煤层气的定义 .11.1.2 微生物增产煤层气的机理 .11.2国内外煤层气研究现状 . 41.2.1 国内现状 .41.2.2 国外现状 .41.3本文研究背景及研究内容 . 5第 2 章 煤层环境中微生物群落结构分析. 72.1实验方法 . 72.1.1基因组 DNA 的提取与纯化 . 72.1.2 菌群种类和丰度测定 .92.2 实验结果分析 . 102.2.1基因组 DNA 分析 . 102.2.2 群落种
8、类和丰度分析 .112.3 本章小结 . 15第 3 章 微生物增产煤层气的机理研究. 163.1 增产煤层气效果分析 . 163.1.1 气体组分分析 .163.1.2 气体同位素分析 .223.2 微生物对煤组分和结构的影响 . 233.2.1 煤样品组分分析 .233.2.2 煤样结构分析 .273.3 本章小结 . 30第 4 章 结论. 32致 谢 . 33中国石油大学（华东）本科毕业设计（论文）参考文献.34第 1 章 前言第 1 章 前言煤层气是一种以甲烷为主要成分的天然气体，又称煤层甲烷，是煤的伴生矿产资源，一般吸附在煤层表面，少数分布于煤孔隙或溶解在煤层水中。由于煤层气是一种
9、洁净能源，且具有气体轻、埋藏浅以及易于开采、经济价值高等特征，近年来在国际上受到科研人员的广泛关注。我国的煤炭资源十分丰富，采煤的同时伴随着煤层气的释放，因此煤层气储量也十分可观，总量位居世界第三。然而由于我国煤体结构复杂，煤体构造破坏严重，占煤层气资源量半数以上的“软煤”普遍发育，其渗透率仅有(10 -3-10-4)10-3 m2 数量级 1-2，严重制约了我国煤层气产业的发展，因此亟需探索全新的煤储层增透技术。由于煤层气按成因可分为生物成因煤层气和热成因煤层气，因此目前人们对利用微生物降解煤生成甲烷这一观点逐渐达成共识，即只要温度、压力、pH 值、Eh 值、矿化度和营养物质满足微生物的生长
10、要求，就可以把煤转化为以甲烷为主的气体 3-7，且微生物的代谢速度与煤颗粒大小成反比，颗粒越小产气效果越好 8。美国粉河盆地的煤层气开发表明微生物对煤的转化可以获得持续的煤层气资源 9，澳大利亚 Apex 公司提出向煤层中注入甲烷菌可以刺激生物气的生成 10。这表明利用微生物对煤层气进行开发和利用具有重要的意义。1.1 微生物增产煤层气概述1.1.1 微生物增产煤层气的定义微生物增产煤层气的概念首先由 Scott 提出 11。他指出，在煤层中注入厌氧微生物种群，然后加入微生物生存所需的有机物，微生物就能够将煤逐步降解，从而产生甲烷来达到增产煤层气的效果。而且这一技术不仅能够增加煤层气的产量，煤
11、层的渗透性也能通过微生物的降解作用来增加，从而解决煤层气开采困难的问题。1.1.2 微生物增产煤层气的机理微生物增产煤层气的机理是煤层中的微生物在一定的条件下，通过降解煤产生以甲烷为主的气体。煤是大分子化合物，一般来说，生成甲烷的过程可以用传统生物气产生的机理解释，即首先生成酸，然后产氢，最后生成甲烷，如图 1-11第 1 章 前言所示。但是相对于普通的大分子有机物，煤分子中含有氧、氮、硫等元素，是复杂的碳水化合物，其中含有大量的杂环、苯环和脂环，结构更加紧密，微生物作用时产生甲烷的难度更大。图 1-1 复杂有机质厌氧发酵产甲烷的代谢途径示意图因此 Strapo 总结出了微生物通过降解煤从而增
12、产煤层气的可能途径。降解过程首先是煤大分子结构分解为小分子片段，即煤分子中共价键的断裂或是官能团的破坏；然后在多种微生物的共同相互作用下生成中间代谢产物；再经过微生物的发酵作用后，将中间产物转化为生成甲烷所需要的底物，从而被产甲烷菌利用生成甲烷 12。2第 1 章 前言图 1-2 煤的生物降解过程及中间产物具体过程如图 1-2 所示，“路径 1”为煤样经过微生物处理过后，煤样被降解为复杂芳烃有机物、聚合物及单体化合物，其中这些复杂芳烃有机物、聚合物及单体化合物被微生物的代谢作用分解为带有羧基、羟基、羰基的脂肪酸、有机酸和醇类等中间产物；“路径 2”表示这些中间产物被进一步降解为甲烷底物（二氧化
13、碳、乙酸及氢气等简单化合物）；“路径 3”为甲烷底物在产甲烷菌的作用下形成甲烷。从图中可以看出中间产物种类多样，说明煤层甲烷的产生需要多种具有不同代谢功能的微生物参加，相互配合共同完成。因此，从煤到甲烷需要经过一系列的物质转化，煤层甲烷的产生需要多种相互作用的微生物参加。产甲烷菌不具有直接分解有机质的能力，它主要以发酵菌和产氢气产乙酸菌分解有机质而产生的 CO2、H 2 和乙酸等作为碳源和能源，最终生成甲烷。产甲烷古菌可分为三大类，第一类产甲烷古菌包括Methanobacteriales、Methanococcales、Methanopyrales，多以 H2/CO2 为底物，某些成员可利用甲
14、酸；第二类是 Methanomicrobiales ，利用的底物类型与第一类产甲烷菌类似，有些可利用仲醇；第三类是 Methanosarcinales，具有多细胞结构，至少可以利用 9 种底物，包括 H2+CO2、一氧化碳、甲醇、醋酸、甲基胺、2,3- 甲3第 1 章 前言基胺以及乙基二甲基胺等。1.2 国内外煤层气研究现状自上世纪 80 年代提出生物成因气的概念以来 13，世界上许多国家开始涉足微生物增产煤层气领域。利用地球化学方法，如同位素检测、煤层气的气体组成分析等，世界各地的生物成因煤层气被源源不断的检测出来 14-16，而且生物成因煤层气还是许多煤田煤层气的主要来源 17-19。由此
15、，现存煤层中是否存在与生物成因煤层气产生相关的微生物，它们的活性如何、如何作用等问题成为研究者关注的焦点。1.2.1 国内现状近年来，随着微生物技术的发展，对煤层中生物成因煤层气微生物学的机理有了进一步认识，煤层气田产出水和煤样中微生物的分析技术也得到了极大促进和提高。我国对微生物增产煤层气的研究起步较晚，目前工作主要集中在模拟成气实验方面，在厌氧细菌的计数、分离、富集培养方面已经取得了一定的成果，但在煤地质微生物分离上还没有取得突破。其中刘洪林等人从低煤阶煤层样品中分离出来产甲烷菌，并发现其中含有的产甲烷菌在适宜的地质条件下能够分解煤层产生甲烷气体。苏现波等人研究了微生物生成甲烷的影响因素，
16、确定了产甲烷的最适 pH 为 8，否则会导致甲烷含量的减少；相比于 pH，盐度的影响较小，但当盐度超过一定值时，甲烷的生成量也会大幅降低 20。此外，林海等人对产甲烷菌群进行了驯化，发现该菌群的产气能力得到显著提高。在新技术的支持下，虽然取得了一定成果，但是在生物降解煤产甲烷方面认识仍然不足，在代谢过程中有哪些微生物参与，各微生物在代谢过程中的作用如何等问题还需要进一步探索。1.2.2 国外现状在煤层微生物的研究领域，国外已经有很多经验，相比于国内的实验室实验，对煤炭生物成气过程中微生物菌群的分离培养及其特性研究已有较多成果，已经深入到分子化学水平。Michael 等人从粉河盆地煤层气井水样中
17、富集培养获得了本源产甲烷菌，4第 1 章 前言论证了该盆地的煤层中存在活性产甲烷菌群，且它们可以利用煤作为主要基质生产甲烷；并且利用 16S rRNA 序列分析，确定了不同微生物之间的进化关系和同源性 21。Singh 等人从煤层水水样中提取 DNA 后用古生菌和细菌的引物进行16Sr RNA 扩增，并鉴定出有甲烷杆菌目和甲烷微菌目的微生物存在，这些微生物以 H2 和 CO2 为基质合成甲烷。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术和 16S rRNA 焦磷酸测序在煤层水微生物的研究中也得到应用。在煤层气开采利用方面，国外也只有少数国家
18、进入大规模工业化生产，大部分都处于基础研究阶段，煤层气开发利用进程需要进一步加快。1.3 本文研究背景及研究内容通过查阅文献了解到，目前研究者对微生物增产煤层气的探索正逐步增加，对于生物成因煤层气的定义以及生物甲烷的形成过程也有了大量研究，微生物增产煤层气技术正受到越来越多的关注。但是受到传统微生物分离培养方法的限制，分离出的微生物仅占环境样品总数的 1% 10% ，不利于对煤层微生物种类的全面分析，阻碍了对煤层气形成机理的微观研究。随着分子生态学技术的发展，采用高通量测序技术可以较好地解决这一问题。高通量测序技术是一种能够进行深度测试的分子生态学技术，它的发展极大的克服了普通分子生态学技术的
19、局限性，保证了丰度较低的物种也能正确地检测出来，对物种的分析更加准确。因此，本研究首先采用高通量测序技术对煤层中菌群的组成和丰度进行分析，明确取样点环境中存在的优势菌群的种类和数量，分析出煤层环境中对生物甲烷代谢起有利作用的细菌和古菌种类，为解析参与煤层有机质降解形成甲烷的优势菌群提供科学依据。在微生物增产煤层气的作用机理方面，虽然对煤层气的形成过程有了一定研究，但是在产物气体组分分析以及微生物对煤结构的影响方面还需进一步研究。因此，本研究内容针对微生物与煤作用前后的代谢产物及华北油田提供的煤样进行煤组分和结构分析，以明确微生物对煤层气增产的影响机制。采用气相色谱分析法对微生物作用后的代谢产物进行分析，明确微生物对煤的作用程度及煤层气的成因类型；运用红外光谱法测定微生物代谢后煤样官能团的变化；采用XRD 检测分析微生物作用后煤结构的变化情况，以及压汞法检测微生物作用前后煤样孔隙率及孔径的变化。由此总结出煤层环境中的微生物群落及其对煤的作5
