1、1浅谈甘油的原理与创新宁摘要:以带小棒链霉菌 XC-1-35为出发菌株，经紫外线照射 60s，并结合甘油耐受性菌株的理性筛选，选育得到较佳诱变株 XC-5-48，效价达 1970g/ml。该菌株经斜面连续传代 4次，效价稳定在 1800g/ml 以上。对该菌株的生理特性研究表明，其具有活力较强的甘油特异诱导的甘油转运系统(GTS)。以 XC-5-48菌株为试验菌株，当培养基中甘油初始浓度为 1.5%，并且在发酵 60h时补加 1.0%的甘油，摇瓶发酵的效价可达2668g/ml，较出发菌株(318g/ml)提高了 7.4倍。该工艺应用于 15L发酵罐共十个批次的发酵试验，96h 时克拉维酸的平均
2、效价达2103g/ml。 关键词：甘油；原理；创新 Abstract: in Streptomyces clavuligerus XC-1-35 as starting strain, after UV irradiation of 60s, and combining with the screening of glycerol tolerance strains breeding is rational, mutant XC-5-48, the titer of 1970 g/ml. The strain was inclined 4 passages, was stable at mor
3、e than 1800 g/ml. Study shows that physiological characteristics of this strain, which has strong glycerol glycerol transport system activity induced (GTS). Strain XC-5-48 was selected as the test strain, when the initial concentration of glycerol medium for 1.5%, and 2adding 1% glycerol in fermenta
4、tion 60H, fermentation in shake flask titer reached 2668 g/ml, compared with the starting strain (318 g/ml) increased 7.4 times. Fermentation is the process used in 15L fermentation tank, a total of ten batches, the average titer 96h clavulanic acid reached 2103 Keywords: glycerol; principle; innova
5、tion 1 材料与方法 (1)菌种 带小棒链霉菌(Streptomyces clavuli-gerus)XC-1-35，系浙江医药股份有限公司新昌制药厂保藏菌株。 (2)培养基及培养条件 斜面及平板培养采用高氏 1号培养基，28培养 89d。 种子培养 250ml三角瓶装 30ml培养基，置旋转式摇床 28，220r/min振荡培养 48h。培养基成分(g/L)：可溶性淀粉 15，甘油 15，鱼粉 20，CaCO3 3，pH6.57.0。 摇瓶发酵 250ml三角瓶装 30ml培养基，接种量 10%，28，220r/min振荡培养 96h。培养基成分(g/L)：淀粉 50，甘油 5，黄豆粉3
6、0，玉米浆 5，CaCl2 0.1，NaCl 0.1，FeSO47H2O 0.1，MgCl26H2O 0.1，KH2PO4 0.8，CaCO3 3，pH6.57.0。 (3)分析方法 克拉维酸含量测定发酵液采用 6mol/L盐酸调 pH至3.54.0，3500r/min 离心 10min，去除菌丝体和固体残渣，吸取 5ml上3清液，12000r/min 离心 10min后，用重蒸水适当稀释，供 HPLC检测。色谱条件为：色谱柱 C18，ODS(4.6mm150mm)，柱温 25。检测器：VWD(SPD-10A)，检测波长 220nm，流动相：0.02mol KH2PO4乙腈(40012，体积比
7、)，流速 0.7ml/min，进样量 10l。 菌丝浓度测定取 10ml发酵液，4000r/min 离心 15min，测得沉淀物在发酵液中所占的比例即为菌丝浓度。pH 测定 pH电极测定。 (4)菌种诱变处理 单孢子悬液的制备将冷冻孢子移种子斜面，培养成熟后加入500g/ml 的无菌咖啡因溶液(作助变剂)，刮下孢子并打散，用无菌滤纸过滤即得。 诱变处理吸取 5ml单孢子悬液于无菌平板中，置于功率为 30W，波长253.7nm的紫外灯直下 30cm处开盖振荡照射 60s，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂平板，28，避光培养 9d左右，挑取单菌落转接斜面。 (5)甘油耐受性突变株的筛选 将经紫外线
8、照射的孢子悬液稀释后，分别涂布于含有一定甘油浓度的分离平板上，28培养 912d。 2 结果与讨 2.1 甘油耐受性突变株的筛选 带小棒链霉菌存在着甘油诱导的甘油转运系统(GTS)，在甘油耐受性高的菌株中 GTS活力强，可高效转运甘油合成克拉维酸。为此，试验中采用耐受高浓度甘油的平板筛选 UV诱变后的突变株。 (1)菌株 XC-1-35对甘油的耐受性考察 4分别将未诱变处理和经 UV诱变处理后的 XC-1-35菌株的单孢子悬液，采用梯度稀释后涂布于含不同浓度甘油的分离平板上，结果如研究发现，未经处理的对照组在含 12%以上甘油浓度的平板上无菌落生长，其甘油耐受浓度为 10%；经 UV诱变处理的
9、诱变组在含 14%甘油浓度的平板上还可生长出少量呈光秃型的小菌落，并且随着平板中甘油浓度的增加，菌落的生长速度也随之减慢，其培养时间由对照的 9d延长到 13d。 (2)甘油耐受性突变株的选育 将经 UV诱变处理 60s后的 XC-1-35单孢子悬液适当稀释后涂布在含14%甘油浓度的分离平板上进行培养，筛选耐高甘油浓度突变株，共挑取了 93支耐受菌株转接斜面。摇瓶发酵初筛及复筛结果表明，采用筛选甘油耐受性突变株的选育效果比较理想，正变率达到 63.3%，负变率仅为3.3%。利用该抗性突变株筛选方法，试验中共进行了 5轮的菌种选育，得到高产菌株 XC-5-48的效价达 1970g/ml，为出发菌
10、株(318g/ml)的 6.2倍。该诱变株经斜面连续传代 4次，发酵效价稳定在 1800g/ml以上，表明其高产性能稳定，可用于进一步的对照组和诱变组的甘油耐受浓度比较验。 2.2 突变株 XC-5-48与出发菌株 XC-1-35的生理特性研究 Miuambres 等认为克拉维酸产生菌中具有两种不同的转运甘油分子系统。其中透过细胞 90%以上的甘油是由甘油转运系统(GTS)转运的。GTS是一种分布于细胞膜上的透性酶(转运酶系)，酶活性的最适 pH为 7.0，最适温度为 2335，Km 为 14mol/L，半衰期为 8h左右。该透性酶的活性中心含有-SH 基团，其转运能力与细胞膜结构的完整程度相
11、关，并受5到 L-丝氨酸等某些物质的抑制。为此，试验中通过向发酵培养基中添加不同浓度的影响 GTS系统活性的因素，如丝氨酸、碘乙酸、脂肪酸，分别观察其对突变株 XC-5-48与出发菌株 XC-1-35的生长代谢及产物合成的影响，以了解突变株的生理特性。 (1)L-丝氨酸的影响分别将突变株 XC-5-48与出发菌株 XC-1-35的种子培养液接种在含不同浓度 L-丝氨酸的发酵培养基中，进行摇瓶二级发酵，发酵 96h后放瓶，测定 pH、菌浓、效价，以不含 L-丝氨酸的发酵培养基为对照。结果表明，L-丝氨酸不仅阻遏了克拉维酸的合成，同时还抑制了菌体的生长，随着 L-丝氨酸加量的增加，抑制作用增强。L
12、-丝氨酸对出发菌株的影响较小，当添加 0.3%的 L-丝氨酸量时，菌浓下降23.5%，发酵效价下降 19.5%；对突变株 XC-5-48添加 0.2%的 L-丝氨酸时，菌浓下降 52.6%，效价下降 44.6%，当 L-丝氨酸添加量为 0.3%时，效价下降了近 70%。表明突变株 XC-5-48的诱导型 GTS系统的转运能力受到L-丝氨酸的强烈抑制。 (2)碘乙酸的影响将突变株 XC-5-48与菌株 XC-1-35的种子培养液分别接种在含不同浓度碘乙酸的发酵培养基中，进行摇瓶二级发酵，发酵96h后放瓶，测定 pH、菌浓、效价，以在不含碘乙酸的培养基中发酵为对照。 碘乙酸对出发菌株 XC-1-3
13、5的生长和产物合成影响均较小。对突变株 XC-5-48而言，低浓度的碘乙酸对生长和产物合成有较显著的抑制作用，随着碘乙酸加量的增加，其抑制作用增强，当浓度达到 0.05%时，菌浓下降 34.2%，效价降低 70%以上，表现出对菌株生长和克拉维酸生物合6成都有强烈的抑制作用。据报道碘乙酸是酶活性中心含有-SH 基团的膜透性酶的灭活剂。试验表明，碘乙酸能强烈抑制突变株 XC-5-48的 GTS的转运甘油能力，造成产量大幅度下降。 (3)脂肪酸的影响据报道，具有表面活性的脂肪酸(C6 以上)严重影响 GTS转运甘油的能力，随链长的延长其表面活性增强，对 GTS转运能力的抑制作用增强。GTS 转运甘油
14、能力与细胞膜结构的完整性相关。 试验中将突变株 XC-5-48与菌株 XC-1-35的种子培养液分别接种在含不同浓度辛酸(八碳酸)和月桂酸(十二碳酸)的发酵培养基中，进行摇瓶二级发酵，发酵 96h后放瓶，测定 pH、菌浓、效价，以菌株在不含脂肪酸的培养基中的发酵结果为对照。 脂肪酸对出发菌株的生长和克拉维酸生物合成有一定的影响，对突变株 XC-5-48的克拉维酸生物合成表现出强烈的抑制作用。加入 5mmol/L的八碳酸(辛酸)使效价较对照下降 43%，而加入 5mmol/L的十二碳酸(月桂酸)则使效价下降 83%，不同浓度 L-丝氨酸对突变株 XC-5-48与菌株XC-1-35发酵的影响。不同
15、浓度碘乙酸对突变株 XC-5-48与菌株 XC-1-35发酵的影响。不同浓度脂肪酸对突变株 XC-5-48与菌株 XC-1-35发酵的影响明随着脂肪链长度的增加，其对克拉维酸生物合成的抑制作用也随之增强。 2.3 甘油对克拉维酸生物合成的影响 Romero 等报道，甘油浓度为 110mmol/L时，克拉维酸的生物合成速率最大，高于此甘油浓度，克拉维酸生物合成则受到抑制。试验中考察了不同甘油浓度及不同甘油补入时间对克拉维酸生物合成的影响。 7(1)不同甘油浓度对甘油耐受株 XC-5-48与出发菌株 XC-1-35发酵的影响将突变株 XC-5-48与出发菌株 XC-1-35的种子培养液分别接种于含
16、不同浓度甘油的发酵培养基中，进行摇瓶二级发酵，96h 后测定效价，以出发菌株 XC-1-35在 0.5%甘油浓度下发酵为对照。随着培养基中甘油浓度的增加，菌株 XC-1-35的发酵效价随之降低，而突变株的发酵效价却不断提高，在甘油浓度为 1.5%时达最高值。这充分表明在甘油耐受性突变株 XC-5-48中，甘油转运系统(GTS)活力强，能高效转运甘油用于合成克拉维酸。在出发菌株 XC-1-35中，GTS 系统活力弱，不能快速地转运甘油，过剩的甘油造成碳氮比过高，使发酵液粘度增大，引起溶解氧浓度下降，影响克拉维酸的生物合成。 (2)甘油补入时间对克拉维酸生物合成的影响当基础培养基中甘油浓度超过一定
17、范围时可抑制克拉维酸的生物合成， 但甘油又是克拉维酸合成的直接前体，合成过程中需要甘油存在。为解决这一矛盾，试验中采取了发酵过程中补加甘油的方法。即发酵培养基，不同浓度甘油对甘油耐受突变株 XC-5-48与出发菌株 XC-1-35发酵的影响 初始甘油浓度为 1.5%，在摇瓶发酵至 24、35、48、60、72 和 84h时分别补入 1.0%的甘油，继续培养至 96h放瓶，以不补加甘油为对照，考察甘油补入时间对克拉维酸生物合成的影响。甘油补入时间对克拉维酸生物合成的影响结果表明，发酵至 4872h 时补加甘油均能提高克拉维酸的产量，60h 补加甘油的发酵效价最高，较对照提高 12%，此时菌体进入
18、大量合成克拉维酸阶段，需要大量的前体，适时补加甘油，能充分发挥菌体的产物合成潜力，大幅度提高发酵效价。过早补加甘油，由于8基础料中甘油残留浓度仍较高，从而抑制克拉维酸的生物合成；补加时间过迟，由于菌体合成克拉维酸的能力下降，前体的加入对克拉维酸生物合成的作用不大。 (3)甘油最佳补入量的选择 前体在一定条件下能控制菌体合成药物的方向和增加药物产量。但过量的前体往往会影响菌体的代谢，甚至对菌体产生毒性，如过量的甘油浓度就会抑制克拉维酸的生物合成，发酵过程中须控制甘油的补入量。为研究克拉维酸发酵中前体甘油的最佳补入量，试验中采用摇瓶发酵到60h时，补入不同浓度的甘油，然后继续培养到 96h放瓶，测定克拉维酸的效价. 3 、结语 以带小棒链霉菌 XC-1-35为出发菌株，经紫外线照射筛选甘油耐受性突变株，得到高产菌株 XC-5-48，其效价为出发菌株的 6.2倍。该菌株传代性能稳定，而且具有活力较强的由甘油特异诱导的甘油转运系统(GTS)，一些对 GTS有抑制作用的物质，如丝氨酸、碘乙酸等抑制克拉维酸的生物合成，降低产量。当发酵培。
