1、北京百奥康生物技术有限公司北京市通州工业园云景东里 361-622 邮编:101101 电话/传真:010-81517573 E-mail:lu_利用偶氮酪蛋白测定内切蛋白酶酶活操作说明书底物:用对氨基苯磺酸染色酪蛋白制备成为偶氮酪蛋白，染色过程是经严格控制的，其灵敏度是其它产品的5倍（如：Sigma Chemical Co., Azo-CaseinLot. 74H7165） 。溶解:将粉末状的底物(2 g)放入120 ml烧杯中，加入4 ml乙醇或工业甲基化酒精(IMS)，用磁力搅拌器充分混合，打碎所有的块状底物，然后加入96 ml磷酸钠缓冲液(100 mM, pH 7.0;Buffer A
2、)，再次充分搅拌直到底物全部溶解（大约10分钟），可用玻璃棒驱散任何粘住烧杯边缘的偶氮酪蛋白，溶解完全的溶液保存于可密封的容器中，加入2滴甲苯以防止微生物的污染，4C下保存，可以保存数周。应用:偶氮酪蛋白可以用于测定所有内切-蛋白酶对于酪蛋白的酶活，如细菌碱性蛋白酶(e.g. Subtillisin A, as in Alcalase from Novo Nordisk)、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、真菌性和细菌性蛋白酶以及菠萝蛋白酶。此说明书中提供了枯草杆菌蛋白酶A、胰蛋白酶和糜蛋白酶的标准曲线，对于其他的蛋白酶，提供有计算用的回归方程式，偶氮酪蛋白测定蛋白酶酶活的灵敏度低于蛋白酶AK测试药片的灵
3、敏度（大约20-50% ）。标准曲线适合于在pH 7.0下制作，对于在更广泛的pH和温度等条件下，使用内切蛋白酶制作标准曲线，并不是每一种情况下都能产生标准曲线，对于特定需求，您可以直接联系我们。提取、稀释和试验用的缓冲液:BUFFER A: (磷酸钠, 100 mM, pH 7)用900 mL蒸馏水溶解17.8 g二水磷酸氢二钠(Na 2HPO42H2O)，并用1 M 氢氧化钠(40 g/L)调节pH到7.0，然后将体积调整到1L，4C下保存，可加入叠氮化钠(0.2 g; Sigma S-2002)作为防腐剂使用。BUFFER B: (磷酸钠, 100 mM, pH 7),半胱氨酸(30 m
4、M)和EDTA (30 mM)用450 mL蒸馏水溶解8.9 g二水磷酸氢二钠(Na 2HPO42H2O)、一水L-盐酸半胱氨酸(2.65 g; Sigma C-7880)和乙二胺四乙酸(5.6 g, EDTA; Sigma ED2SS)，并用1 M氢氧化钠(40 g/L) 调节pH到7.0，然后将体积调整到500 m L，4C下保存，2天内使用完。注意：对于硫羟基蛋白酶（如：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶）需要使用Buffer B进行提取和稀释，对于其他蛋白酶可以使用Buffer A 酶的提取和稀释:1.0 g粉末状酶制剂加入50 mL的Buffer A或B，在室温中用磁力搅拌器充分搅
5、拌15分钟（直到粉末全部溶解或驱散），如有必要可以过滤或离心(1,000g) ，此溶液即为最初提取液，还需要进一步对提取液进行稀释 (1 mL+9 mL of Buffer A or B)直到适合于试验要求的浓度。1.0 mL液体酶制剂加入49 mL的Buffer A或B，并充分搅拌混匀，如有必要可以过滤或离心(1,000 g)，此溶液即为最初提取液，还需要进一步对提取液进行稀释(1 mL+9 mL of Buffer A or B)直到适合于试验要求的浓度。（Alcalase 蛋白酶大约需要100倍稀释）实验步骤:1. 1.0 ml 已经处理好的酶溶液用Buffer A或B(pH 7.0)加
6、入1.0 ml已经用Buffer A处理好的底物2. 用漩涡混合器充分混合并在40C下孵育10分钟3. 加入5%的三氯醋酸(TCA, 6.0 ml)，用漩涡混合器充分混合5秒钟，未水解的偶氮酪蛋白被沉淀，反应结4. 将反应管置于室温下，平衡5分钟，然后用Whatman No.1 (9 cm)滤纸过滤，或者在3,000 rpm (1,000g)下离心10分钟5. 相对于空白对照在440 nm 下测定反应管的吸光度值北京百奥康生物技术有限公司北京市通州工业园云景东里 361-622 邮编:101101 电话/传真:010-81517573 E-mail:lu_标准曲线:图1-3表示的是在pH 7.
7、0和40C条件下，枯草杆菌蛋白酶A、胰蛋白酶和糜蛋白酶与偶氮酪蛋白(Lot 81001; absorbance 440 nm)反应，所测得的蛋白酶相对与酪蛋白（pH 7.0和40C）的酶活标准曲线，对于枯草杆菌蛋白酶A所呈现的是直线相关性曲线，然而，对于胰蛋白酶和糜蛋白酶显然就是非直线性曲线，以下列出了其他各种蛋白酶的回归方程式，枯草杆菌蛋白酶A、胰蛋白酶和糜蛋白酶的计算方程式与此类似，木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的斜率非常大，可能是由于提取液中高含量的肽酶在酪蛋白试验中一同被测量了，但是在偶氮蛋白酶试验中没有被测定所导致的，关于蛋白酶的进一步研究正在进行之中。木瓜蛋白酶(from Papaya l
8、atex):蛋白酶 (milli-Units/mL) = 270 x Abs. (440 nm) + 7; R = 0.99线性吸光度范围 = 0.1-1.0菠萝蛋白酶(from pineapple stem):蛋白酶(milli-Units/mL) = 460 x Abs. (440 nm) - 13; R = 0.99线性吸光度范围= 0.1-0.9无花果蛋白酶(from figs):蛋白酶(milli-Units/mL) = 190 x Abs. (440 nm) + 3; R = 0.99线性吸光度范围= 0.1-1.1枯草杆菌蛋白酶A (from Bacillus lichenifo
9、rmis):蛋白酶(milli-Units/mL) = 129 x Abs. (440 nm) + 4; R = 0.99线性吸光度范围= 0.1-1.0细菌性蛋白酶 (from Bacillus subtilis):Protease (milli-Units/mL) = 250 x Abs. (440 nm) -8; R = 0.99线性吸光度范围= 0.1- 1.0蛋白酶 K (from Tritirachium album):蛋白酶(milli-Units/mL) =140 x Abs. (440 nm) - 4; R = 0.99线性吸光度范围= 0.1-1.0真菌性蛋白酶(A. ni
10、ger; from Sigma Chemical Co.):蛋白酶(milli-Units/mL) = 146 x Abs. (440 nm) - 4; R = 0.99线性吸光度范围= 0.1-1.01个蛋白酶活单位被定义为：单位时间内，在标准实验条件下(pH 7.0；40C)，将可溶性酪蛋白水解成1微摩尔酪氨酸所需要酶的数量。北京百奥康生物技术有限公司北京市通州工业园云景东里 361-622 邮编:101101 电话/传真:010-81517573 E-mail:lu_计算:通过参考标准曲线或回归方程式可以将吸光度单位转换成为每个试验中蛋白酶的单位（milliUnits） ，并根据下列公式计算出蛋白酶的酶活单位:最初提取液Units/ml:= milliUnits/每个试验 x 50 x 1 x 稀释系数1000注释:milliUnits/每个试验(i.e./1.0 ml)可以通过标准曲线或回归方程式得到50 = 缓冲液体积 (i.e. 1g/50ml或1ml酶制剂加入49ml 缓冲液).1/1000 =由milliUnits转换为Units稀释系数 = 稀释最初缓冲液的实际稀释倍数
