1、IL12+ 重组卡介苗对新生期小鼠脾脏 T 细胞功能亚群发育的影响作者：何云, 刘恩梅*, 杨锡强, 李欣, 刘玮【摘要】 目的: 研究 IL12+ 重组 BCG新生期接种对小鼠脾脏 T细胞功能亚群发育的影响。 方法: 新生清洁级 BALB/c小鼠 24只, 分对照组、 BCG组和 IL12+ 重组 BCG组。新生期接种, 4周后取脾细胞用流式细胞术检测 CD3+CD8+IFN+ 、 CD3+CD8-IFN+ 、 CD3+CD8+IL +、 CD3+CD8-IL +、 CD4+Foxp3+ T细胞的比例, 其分别代表 Tc1、 Th1、 Tc2、 Th2 和调节性 T细胞亚群。 结果: BCG
2、 组、IL12+ 重组 BCG组 Th1、 Tc1细胞比例明显高于对照组（P0.05或 P0.01）, BCG组与 IL12+ 重组 BCG组比较没有统计学意义; Tc2、 Th2和调节性 T细胞比例各组间比较没有统计学意义; 二接种组Th1/Th2、 Tc1/Tc2和总 IFN/IL4 比值明显高于对照组（P0.05 或 P0.01）; CD4+Foxp3+ T细胞比例各组间比较没有统计学意义(P0.05)。结论: 新生期 BCG和 IL12+ 重组 BCG接种组接种均能促进 Th1、 Tc1细胞亚群的发育, 提高 Th1/Th2、 Tc1/Tc2比值, 但不能影响 CD4+FoxP3+Tr
3、eg细胞的比例。 【关键词】 卡介苗 白细胞介素 12 T细胞亚群 调节性 T细胞Abstract AIM: To explore the effects of recombinant Balillus CalmetteGuerin secreting IL12 on the development of spleen T cell subsets of neonatal BALB/c mice. METHODS: Twentyfour neonatal BALB/c mices were divided 3 groups: Control, BCG , rBCG groups, which
4、inoculated with BCG and rBCG intraperiotoneally within 2-3 days after birth. Four weeks later, spleen cells of mice were isolated and the percentage of CD3+CD8+IFN+/CD3+CD8IFN+/CD3+CD8+IL +/ CD3+CD8-IL +/ CD4+Foxp3+ T cells , which represent Tc1/Th1/Tc2/Th2/Treg cells respectively were detected by f
5、low cytometry at single cells level, and Th1/Th2, Tc1/Tc2 ratio were calculated. RESULTS: The percentages of Th1, Tc1 cell of BCGvaccinated mice, rBCG vaccinated mice were significant higher than control mice (P0.01), and there was no difference between the two vaccinated groups. The ratio of Th1/Th
6、2, Tc1/Tc2 and total IFN/IL of two vaccinated groups were higher than control group. The percentages of Treg cells were no difference among the three groups (P0.05). CONCLUSION: Neonatal BCG and rBCGvaccination can significantly increase Tc1 and Th1 cells and Th1/Th2, Tc1/Tc2 ratio in spleen cells.
7、Neonatal BCG and rBCG vaccination may have an same effects on development of T cell subsets in neonatal BALB/c mice. The percentage of CD4+Foxp3+ T cells among three groups were no significant difference.Keywordsbacillus calmetteguerin; interleukin12; T cells subsets; regulatory T cell卡介苗（bacillus c
8、almetteguerin, BCG）可通过诱导 Th1/Tr免疫应答而保护哮喘, 我们前期研究发现呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）能逆转新生期 BCG接种的抗哮喘作用, 其机制尚不清楚1, 2 。IL12 是 Th1分化发育的关键细胞因子。皮下注射重组 IL12 能减少哮喘患者嗜酸性粒细胞水平, 但降低气道高反应性的作用不明显, 也不能改善随后的哮喘症状, 并有严重的副作用3 。我们将 IL12 与 BCG重组后能避免直接使用重组 IL12 的副作用, 又能增强 BCG的 Th1/Tr应答, 并分别以 CD3+CD8+IFN+ 、 CD3+C
9、D8-IFN+ 、 CD3+CD8+IL4+ 、 CD3+CD8-IL +、 CD4+Foxp3+ T细胞代表 Tc1、 Th1、 Tc2、 Th2及 T调节性细胞水平, 在单细胞水平观察IL12+ 重组 BCG在新生期接种对小鼠脾脏细胞亚群发育的影响。1 材料和方法11 材料 清洁级 BALB/c小鼠购自重庆医科大学实验动物中心, 饲养于专用消毒饲养盒内, 恒定室温。过滤空气 , 饲料、 水皆经消毒处理, 更换饲料等操作在超净台内进行。新生 23 d小鼠共 24只, 分为对照组、 BCG组和 IL12+ 重组 BCG接种组, 每组 8只。BCG 组给以BCG(上海生物制品研究所, 批号 20
10、05030211, 购于重庆市渝中区疾控中心)1105CFU/只腹腔、 皮下联合注射; IL12+ 重组 BCG以 rBCG 1105CFU/只腹腔、 皮下联合注射; 生后满 4周无菌取脾脏进行流式细胞仪检测。1.2 方法121 IL12+ 重组 BCG的构建及鉴定 先构建表达 IL12 的穿梭质粒, 并将其转化入 BCG(本部分实验由重庆医科大学微生物教研室完成)。122 胞内细胞因子（IFN 、 IL ）的流式检测 无菌取脾, 在 300目不锈钢网上少量 PBS冲洗下轻轻研磨制成单细胞悬液, RBC裂解液裂解红细胞, PBS洗 2次, 细胞悬浮与 RPMI1640（含 100 mL/L F
11、BS）, 调整细胞密度为 2109/L, 台盼兰染色计数活细胞数在 95%以上。取 1 mL脾细胞（2109/L 加入 7.5 L 1 mg/L 佛波酯(PMA) 工作液、 6 L 50 mg/L 离子霉素(Ionomycin) 工作液、 1000 U/L BD GolgiStopTM蛋白转运抑制剂（内含 Monensin 2.0 mol/L 终浓度）, 混匀, 37 50 mL/L CO2 培养箱培养 6 h, PBS洗 2次, 加入 0.75 g Ratantimouse CD3: PECy5 、 1.5 g Ratantimouse CD8FITC (荧光抗体均为 BD Parmigen
12、公司产品, 下同), 室温避光孵育 15 min, 分成 3管, 每管 100 L 已染色的脾细胞, 加入 500 L Fixperm 中的固定液室温避光孵育 15 min, 再加入 100 L Fixperm 中溶血破膜液, 1 200 r/min, 洗 2次, 加 100 L 大鼠血清封闭 30 min, 同时分别加入 RatIgG1 controlPE 、 Ratantimouse IFNPE 、 Ratantimouse IL4PE 0.5 g 室温避光孵育 15 min; PBS洗 2次, 0.5 mL PBS重悬细胞上机检测(流式细胞仪型号 Becton Dickinson, US
13、A)。123 胞内转录因子 FoxP3的流式检测 取 1106细胞, 分别加入 Ratantimouse CD4PECy5 (BD Parmigen), 混匀避光孵育20 min, 用细胞染色缓冲液洗 1次, 加 1 mL 1Foxp3 Fix/Perm缓冲液(Biolegend)混匀, 室温避光孵育 20 min, 离心弃上清 , 1Foxp3 Perm缓冲液(Biolegend)洗 2次, 用 1Foxp3 Perm缓冲液重悬细胞, 室温避光孵育 15 min, 离心弃上清, 用 1foxp3 Perm缓冲液重悬, 分成 2管, 分别加入 5 L(1 g) Alexa Fluor 488
14、Ratantimouse FOXP3、 Alexa Fluor 488 Ratantimouse IgG（作为对照抗体）(Biolegend)室温避光孵育 30 min, 用细胞染色缓冲液洗 2次, 用 0.5 mL细胞染色缓冲液重悬细胞上机分析。124 统计学分析 所有数据采用 SPSS13.0统计软件分析, 各组检测结果均以 xs表示, 先进行方差齐性检验, 方差齐者各组样本均数间的比较采用 LSDt 检验, P0.05 为差异有统计学意义。2 结果21 脾细胞胞内 IFN 的检测 BCG组、 重组 BCG组 Th1、 Tc1及总 IFN 明显高于对照组（P0.05 或 P0.01, 表
15、1）, 差异具有统计学意义; 但二组间比较没有区别, 差异无统计学意义(P0.05), 表明 BCG和重组 BCG于新生期接种皆能诱导 Th1、 Tc1亚群发育。表 1 各组胞内 IFN 检测分析（略）Tab 1 Analysis of intracellular IFN among all groupsaP0.05, bP0.01 vs control group.2.2 脾细胞胞内 IL4 的检测 各组 Th2、 Tc2及总 IL4 水平之间差异无统计学意义（P0.05, 表 2） 。表 2 各组胞内 IL4 检测分析（略）Tab 2 Analysis of intracellular I
16、L4 among all groups2.3 Th1/Th2、 Tc1/Tc2及 IFN/IL 比值 BCG组、 rBCG 组 Th1/Th2、 Tc1/Tc2及总 IFN/IL 比值明显高于对照组（表 3） 。表 3 各组 Th1/Th2、 Tc1/Tc2 及 IFN/IL 比值变化（略）Tab 3 Changes of the ratio of Th1/Th2、 Tc1/Tc2、 total IFN/IL among all groupsaP0.05, bP0.01 vs control group.24 CD4+FoxP3+ T细胞在小鼠脾细胞中的表达 对照组、 BCG组及 rBCG 组
17、脾细胞中 CD4+FoxP3+T细胞数分别为（8.32.4）%、 （9.23.2）%和（9.73.4）%, 各组间比较无统计学差异（P0.05） 。3 讨论BCG 通过能诱导 Th1免疫应答而防止哮喘的发生4, 5, 但对人类哮喘的预防作用存在争议6 。我们前期研究发现, 新生期皮下接种BCG后不仅能促进 Th1免疫功能成熟的作用, 而且能通过诱导 Tr1发挥抗哮喘作用1; 早期接种 BCG能抑制致敏原诱发的嗜酸性粒细胞炎症、 支气管周围炎症和气道高反应性; 但作为诱发或加重小儿哮喘最常见的危险因素之一 RSV能逆转新生期 BCG接种的抗哮喘作用2, 其机制尚不清楚。如何增强 BCG诱导 Th
18、1/Tr作用, 使其能有效抵抗 RSV干扰、 预防哮喘发生, 值得进一步的研究。IL12 主要由 DC和巨噬细胞产生, 能够促进 Th1分化发育, 诱导CD4+/CD8+T细胞、 NK细胞、 NKT细胞等产生 IFN, 是衔接天然免疫和特异性免疫的关键细胞因子。皮下注射重组 IL12 能减少哮喘患者嗜酸性粒细胞水平, 但降低气道高反应性的作用不明显, 也不能改善随后的哮喘症状, 并有严重的副作用3 。但 IL12 重组乳酸菌却能明显的逆转哮喘小鼠 Th1/Th2失衡, 降低气道高反应性, 减轻气道炎症7, 8 。提示将 IL12 与某些细菌载体重组, 使其在免疫应答的局部产生免疫调节作用且可避
19、免其副作用。由此, 我们将 IL12 与 BCG重组以避免直接使用重组 IL12 的副作用又能增强 BCG的 Th1/Tr应答。本研究中我们在单细胞水平分析了 rBCG 新生期接种对小鼠脾脏 T细胞亚群的影响, 结果表明小鼠新生期接种 BCG和 rBCG 均能引起明显的 Th1、 Tc1细胞比例增加, 表现为 CD3+CD8-IFN+ 、 CD3+CD8+IFN+ T细胞比例的增加, 说明新生期接种 BCG和 rBCG 均能促进小鼠 Th1、 Tc1 细胞亚群的发育。调节性 T细胞包括 CD4+CD25+调节性 T细胞、 以分泌高水平 IL10为特征的 Tr1和以分泌高水平 TGF 为特征的
20、Th3细胞, 其中 FoxP3是 CD4+CD25+调节性 T细胞发育和功能中关键转录因子, CD4+FoxP3+细胞可以代表绝大多数具有调节/抑制功能的 T淋巴细胞9 。与我们以前的结果相似10, 本研究结果表明新生期接种 BCG和 rBCG 并不能诱导脾脏产生更多的 CD4+FoxP3+的调节性 T细胞亚群。由于没有对CD4+FoxP3+T细胞的功能进行深入的研究, 并不排出新生期接种 BCG后其功能有所变化。但 BCG和 rBCG 组各个指标没有明显差异, 重组后的 rBCG 并没有达到预期效果。我们考虑与以下因素有关: 一是与 IL12 重组质粒在体内分泌 IL12 不足, 不足以影响
21、机体整体免疫应答, 二是目前检测手段还不能区别二组差异。还需进一步研究 rBCG 在体内的功能。综上所述, 新生期接种 rBCG 能促进小鼠脾脏 Th1、 Tc1细胞亚群的发育, 提示在婴幼儿早期阶段接种 rBCG 能促进个体免疫系统的成熟, 向 Th1、 Tc1方向发育, 为在婴幼儿早期阶段应用 rBCG 来预防变态反应性疾病的发生提供一定的理论基础。【参考文献】1 李 睿, 刘恩梅 , 杨锡强, 等. 卡介苗新生期接种和呼吸道合胞病毒感染对小鼠实验性哮喘的联合作用J. 中华儿科杂志, 2006, 44(6): 420-424.2 Li R, Yang X, Wang L, et al. R
22、espiratory syncytial virus infection reversed antiasthma effect of neonatal Bacillus CalmetteGuerin vaccination in BALB/c miceJ. Pediatr Res, 2006, 59(2): 210-215.3 Bryan SA, OConnor BJ, Matti S, et al. Effects of recombinant human interleukin12 on eosinophils, airway hyperresponsiveness, and the la
23、te asthmatic responseJ. Lancet, 2000, 356(9248): 2149-2153.4 Smit JJ, Folkerts G, Nijkamp FP. Mycobacteria, genes and the hygiene hypothesisJ. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004, 4(1): 57-62.5 Barlan I, Bahceciler NN, Akdis M, et al. Bacillus CalmetteGuerin, Mycobacterium bovis, as an immunomodula
24、tor in atopic diseasesJ. Immunol Allergy Clin North Am, 2006, 26(2):365-377.6 Omar MT, Ahmed SH, Sarkis NN. A study of the association between delayed type hypersensitivity reaction to mycobacterium tuberculosis and atopy in asthmatic childrenJ. J Egypt Public Health Assoc, 2005, 80(3-4): 463-474.7
25、Wu C, Yang G, BermudezHumaran LG, et al. Immunomodulatory effects of IL12 secreted by Lactococcus lactis on Th1/Th2 balance in ovalbumin (OVA)induced asthma model miceJ. Int Immunopharmacol, 2006, 6(4): 610-615.8 BermudezHumaran LG, CortesPerez NG, AhLeung S, et al. Current prophylactic and therapeu
26、tic uses of a recombinant Lactococcus lactis strain secreting biologically active interleukin12 J. J Mol Microbiol Biotechnol, 2008, 14(1-3): 80-89.9 Campbell DJ, Ziegler SF. FOXP3 modifies the phenotypic and functional properties of regulatory T cellsJ. Nat Rev Immunol, 2007, 7(4): 305-310.10 李 睿, 刘恩梅, 杨锡强, 等. 新生期小鼠卡介苗接种对脾脏 T细胞功能亚群发育的影响J. 中华儿科杂志, 2005, 43(2): 124-127.
