1、NKG2D 配体的表达直接影响 NK 细胞对不同发育阶段 DC 的杀伤作者：涂三芳, 郭坤元, 胡亮衫 , 梅家转, 周健, 孙明【摘要】 目的: 探讨 NKG2D 配体在不同发育阶段树突状细胞（DC）表面的表达及其对自然杀伤（NK）细胞杀伤活性的影响。方法: 用细胞因子（rh IL-4、 rhGM-CSF、 TNF-）体外诱导培养单核细胞来源的未成熟树突状细胞（iDC）和成熟树突状细胞（mDC）并鉴定形态和表型, 免疫磁珠法分离纯化 NK 细胞。流式细胞术（FCM）检测 iDC 和 mDC表面 NKG2D 配体 MICA/B、 ULBP1-3 的表达。用 LDH 释放法检测 NK 细胞对 i
2、DC 和 mDC 的杀伤活性以及抗 NKG2D 单克隆抗体(mAb)阻断 NK 细胞后的杀伤活性。结果: 培养的 iDC 和 mDC 具有典型的细胞形态和免疫表型特征。iDC 表面表达 MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP3, 表达率分别为(32.398.30）%、 (17.753.40)%、 (26.716.48)%、 (38.376.89)%; mDC 表面表达 MICA 、 ULBP3, 表达率分别为(7.822.67)%、 (8.362.42)%, 比 iDC 表面相应配体表达率低（P0.01） 。各效靶比 NK 细胞对 iDC 的杀伤活性均比对 mDC 的杀伤活性高, 差异
3、有统计学意义(P0.01)。抗 NKG2D mAb 阻断 NK 细胞后对iDC 杀伤活性比阻断前减弱(P0.05); 对 mDC 的杀伤活性与阻断前相比无统计学意义(P0.05)。结论: NKG2D 配体在 iDC 表面表达高, 介导了 NK 细胞对 iDC 的杀伤, 而对 mDC 的杀伤无影响, 是 NK 细胞对 iDC选择性高杀伤的分子机制之一。 【关键词】 NKG2D 配体 自然杀伤细胞 树突状细胞Abstract AIM: To investigate the expression of NKG2D ligands on dendritic cells（DC） at different
4、 development stages and its effect on cytotoxicity of natural killer（NK） cells. METHODS: The monocytes were cultured into immature dendritic cells（iDC） and mature dendritic cells（mDC） with cytokines. NK cells were obtained from normal peripheral blood by CD56 antibody magnetic isolation.The expressi
5、on of NKG2D ligands (MICA/B, ULBP1-3) was detected by flow cytometry. Cytotoxicity of NK cells and the NK cells blocked with anti-NKG2D mAbs against iDC and mDC was tested using LDH-releasing method. RESULTS: IDC and mDC were of typical morphology and phenotypes. MICA, MICB, ULBP1, and ULBP3 were ex
6、pressed on iDC and their expression rate was (32.398.30)%, (17.753.40)%, (26.716.48)%, (38.376.89)%, respectively. MICA and ULBP3 were expressed on mDC and their expression rate was (7.813.33)% and (8.362.42)%, respectively, which was lower than that on mDC (P0.01). At the each ET ratio cytotoxicity
7、 of NK cells against iDC was stronger than that against mDC (P0.01). cytotoxicity of NK cells blocked with anti-NKG2D mAb against iDC was decreased compared with that of NK cells unblocked (P0.05) while cytotoxicity of NK cells blocked with anti-NKG2D mAb against mDC showed no decrease compared with
8、 that of NK cells unblocked (P0.05). CONCLUSION: The expression of NKG2D ligands on iDC is higher than that on mDC, which plays an important role in the cytotoxic effect of NK cells against iDC, but has no effect on that aginst mDC. NKG2D-NKG2D ligands shows one of the moleculer mechanisms that NK c
9、ells kill iDC selectivly.KeywordsNKG2D ligand; natural killer cell; dendritic cell树突状细胞（DC）和自然杀伤（NK）细胞是机体免疫系统最重要的组成部分, 二者之间存在相互作用1 。Ruggeri 等2, 3研究发现在异基因造血干细胞移植中供者 NK 细胞可以通过杀伤宿主 DC 来降低移植物抗宿主病（GVHD）的发生。但 NK 细胞杀伤 DC 的作用机制仍未完全明确。NK 细胞主要通过表面受配体结合起杀伤作用, 本研究旨在通过检测 NKG2D 配体在不同发育阶段 DC 表面的表达水平来探索 NKG2D 受配体识别
10、途径是否参与介导了 NK 细胞对不同发育阶段 DC 的杀伤, 为临床运用NK 细胞降低 GVHD 的发生提供理论依据。1 材料和方法1.1 材料 RPMI1640 培养基和胎牛血清购自 Gibco 公司。重组人白细胞介素-4 ( rh IL-4)、 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子( rhGM-CSF)和肿瘤坏死因子（TNF-）均为 Pep rotech 公司产品。抗CD56 免疫磁珠抗体、 MACS 磁柱和 MACS 细胞分选仪均为 Miltenyi 公司产品。杀伤活性检测试剂盒（Cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay）为 Promega
11、公司产品。CD3FITC、 CD16PECD56PE mAb 为 BD 公司产品。FITC 或 PE 标记的鼠抗人 CD80、 CD86、 HLA2DR、 CD83、 CD1a 单克隆抗体(mAb)及其同型对照均为 eBiosience 公司产品。鼠抗人 NKG2D、 MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP2、 ULBP3 mAb 和 FITC 标记的兔抗鼠 IgG1 购自 RnD 公司。FACScabilur 型流式细胞仪为 Beckman-Coulter 公司产品。1.2 方法1.2.1 人外周血单核细胞来源的 iDC 与 mDC 体外诱导培养与鉴定 常规分离健康志愿者外周血单个核
12、细胞, 以 4109/L 细胞密度接种在 6孔板中, 置于 37、 50 mL/L CO2 培养箱中贴壁培养 4 h 后, 去除非贴壁细胞, 加入含 20 g/L rhIL-4、 50 g /L rhGM-CSF、 100 mL/L胎牛血清的 RPMI1640 培养液, 置于培养箱培养 , 隔天半量换液, 补充等量细胞因子。第 6 天补加 80 g /L 的 TNF-, 共培养 9 d。每天倒置显微镜下观察细胞形态。收集第 6 天和第 9 天细胞用 25 mL/L 戊二醛固定, 漂洗, 脱水, 乙酸异物脂置换, 干燥, 喷金后上机用扫描电子显微镜观察鉴定其形态。同样收集第 6 天和第 9 天细
13、胞计数后分管, 分别加CD80PE、 CD86 PE-CY5、 HLA-DRPE、 CD1aFE、 CD83FITC mAb 4 度标记, 对照管加同型对照 IgG1, 用流式细胞术（FCM）检测各分子的表达, 不同时间点重复 3 次。1.2.2 人外周血来源的 NK 细胞分离 分离另外 3 位健康志愿者外周血单个核细胞, 每 107 个细胞加入 80 L PBS 和 20 L 抗 CD56 免疫磁珠抗体, 4标记 15 min 后洗涤, 用 500 L 的 PBS 充分混匀后加入到磁柱中, 在 MACS 细胞分选仪中分离, 推注器将分选的阳性细胞推入无菌试管, 为 NK 细胞。CD3FITC
14、、 CD16PECD56PE mAb 标记 NK 细胞检测NK 细胞的纯度。1.2.3 iDC、 mDC 表面 NKG2D 配体的 FCM 检测 分别收集鉴定后的 iDC 与 mDC 洗涤计数, 分 6 管, 每管 109/100 mL 细胞悬液, 按 1 g/106 个细胞密度分别加入 MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP2、 ULBP3 mAb, 4 度标记 30 min 后洗涤, 加入 FITC 标记的山羊抗鼠 IgG1 二抗 4 度标记 30 min, 第 6 管加等量同型 IgG1 作为阴性对照, 洗涤后以 FCM 检测MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP2、 U
15、LBP3 的表达量。为避免实验误差 , 不同时间点重复 3 次。1.2.4 NK 细胞对 iDC 与 mDC 杀伤活性的检测 采用 LDH 释放法4, 收集 iDC, mDC 作为靶细胞, NK 细胞为效应细胞, 按照Cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay 杀伤试剂盒说明书操作, 倍比稀释法按效靶比 201、 101、 51 铺板, 阻断组先加抗NKG2D mAb 10 g/100 L 常温下孵育 15 min, 封闭 NK 细胞表面 NKG2D受体, 再加靶细胞。显色后 ELX-800 酶标仪上测 A 值。NK 细胞杀伤率=(实验孔 A 值靶
16、细胞自发释放孔 A 值效应细胞自发释放孔 A 值)/(靶细胞最大释放孔 A 值靶细胞自发释放孔 A 值)100%1.2.5 统计学处理 应用 SPSS13.0 统计软件进行数据处理, 数据以 xs 表示, 采用独立样本 t 检验, P0.05 者表示差异有统计学意义。2 结果2.1 iDC 和 mDC 的形态和表型 倒置显微镜下观察第 6 天细胞大部分半悬浮聚集成簇生长, 胞体增大, 表面可见短小毛刺状突起。第 9天细胞大部分悬浮生长, 表面树突结构明显。扫面电镜下观察第 6 天细胞大小 10 m 左右, 表面突起短小, 多见薄沙或云雾状皱褶, 符合 iDC的形态特征（图 1A）; 第 9 天
17、细胞表面突起更多更长, 呈典型树突状结构, 云雾状皱褶稀疏, 符合 mDC 的形态特征（图 1B） 。FCM 结果显示第 6 天 DC 表面共刺激分子 CD80 和 CD86 分别为（40.87.9）%和（45.13.7）%, HLA-DR 表达为（59.95.2）%, 特异性分子标志物CD1a 高表达为（71.95.2）%, 成熟分子标志物 CD83 低表达为（14.91.9）%, 为不成熟阶段表型。第 9 天测得 CD80、 CD86 和 HLA-DR 表达升高为（71.57.3）%、 （79.96.7）%和（88.66.6）%, CD1a 仍高表达, CD83 表达升高为(65.53.8
18、)%, 为成熟阶段表型。图 1 扫描电镜下观察 DC 形态（略）Fig 1 The morphologies of DC observed by scanning electron microscopeA: Day 6; B: Day 9.2.2 NK 细胞的纯度 FCM 结果显示外周血单个核细胞经免疫磁珠分选后 NK 细胞（CD3-CD16+CD56+）的纯度为（91.664.04）%, 能满足实验要求（图 2） 。图 2 免疫磁珠法分选后 NK 细胞的纯度（略）Fig 2 Purification of NK cells after immunomagnetic isolation2.3
19、iDC 和 mDC 表面 NKG2D 配体的表达 iDC 表面表达 MICA、 MICB、 ULBP1 和 ULBP34 个配体; mDC 表面只表达 MICA、 ULBP22 个配体, 且比 iDC 表面相应配体表达率低, 差异均有统计学意义（P0.01） 。其他配体表达率均低于 5%, 视为阴性结果(表 1, 图 3)。表 1 NKG2D 配体在 iDC 和 mDC 表面的表达率（略）Tab 1 Expression of NKG2D ligands on the surface of iDC and mDCbP0.01 vs iDC.图 3 iDC 和 mDC 膜表面 NKG2D 配体的
20、表达（略）Fig 3 Expression of NKG2D ligands on the surface of iDC and mDC2.3 NK 细胞对 iDC 与 mDC 的杀伤活性 各效靶比 NK 细胞对 iDC的杀伤活性分别高于对 mDC 的杀伤活性, 差异均有统计学意义（P0.01） 。NKG2D mAb 阻断 NK 细胞后, 各效靶比 NK 细胞对 iDC 的杀伤活性降低（P0.05）; 对 mDC 的杀伤活性与阻断前相比均无统计学意义（P0.05）; 阻断后的 NK 细胞对 iDC 的杀伤活性比阻断前 NK 细胞对 mDC 的杀伤活性高, 差异有统计学意义（P0.05, 图 4
21、） 。图 4 抗 NKG2D mAb 阻断前后 NK 细胞对 iDC 和 mDC 的杀伤活性（略）Fig 4 Cytotoxicity of NK cells and the NK cells blocked with anti-NKG2D mAb against iDC and mDC3 讨论NK 细胞和 DC 是机体天然免疫和获得性免疫系统中重要的组成部分, 近年来研究1, 5表明二者在天然免疫早期阶段存在相互作用, DC 能增强 NK 细胞的杀伤活性, 同时 NK 细胞能选择性杀伤 iDC, 到目前为止其杀伤机制仍在探索中。DC 根据发育阶段的不同可分为 iDC 和 mDC, 其在形态,
22、 表型和功能上有所不同6 。NK 细胞的杀伤活性同时受活化性和抑制性受配体结合产生的信号平衡调节起作用7, 其活化性受体主要包括 II 型跨膜蛋白受体 NKG2D 和 NK 细胞自然细胞毒受体 NCR, 与配体结合向 NK 细胞传递活化性信号。NKG2D 配体8主要包括多态性的 MHC-I类链相关的肽 A、 B（MICA/B）和人巨细胞病毒 UL16 结合蛋白(ULBPs), 它们在不同发育阶段 DC 的表达情况尚未见研究报道。我们通过 FCM 分别检测 iDC 和 mDC 表面 NKG2D 配体的表达, 结果显示 iDC 表面表达 MICA、 MICB、 ULBP1 和 ULBP3, 而 m
23、DC 表面只表达 MICA 和 ULBP3, 且表达率很低。因此 iDC 可以通过表面 NKG2D 配体与 NKG2D 结合激活 NK 细胞的杀伤活性, mDC 通过 NKG2D 配体很难激活 NK 细胞。本研究杀伤试验显示 NK 细胞对 iDC 的杀伤活性比对 mDC 的杀伤活性高很多, 与其他研究结果一致9 。NKG2D mAb 阻断 NK 细胞后降低了 NK 细胞对 iDC 的杀伤活性, 但对mDC 的杀伤没有影响。因此可认为 NKG2D 受配体识别信号途径介导了 NK细胞对 iDC 的杀伤, 没有介导对 mDC 的杀伤, 是 NK 细胞选择性高杀伤iDC 的机制之一。NK 细胞的杀伤作
24、用除了受活化性信号作用之外, 同时受抑制性信号的共同调节作用。NK 细胞抑制性信号受体主要包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体 KIR 和 CD94/NKG2A 等, 分别与靶细胞表面的 HLA-类分子和不典型的 I 类分子结合, 向 NK 细胞传递抑制性信号10 。本研究结果显示抗 NKG2D mAb 阻断后对 iDC 的杀伤活性仍比未阻断前 NK 对 mDC 的杀伤活性高, 说明抗 NKG2D mAb 不能完全阻断 NK 细胞对 iDC 的杀伤, 同时其他受配体识别途径介导。除了其他活化性信号途径外, 更主要的就是抑制性信号在二者强弱不等。Ferlazzo 等11发现 mDC 高表达抑制性配体MH
25、C-I 类分子, 而 iDC 低表达, 这可能也是 iDC 被 NK 细胞选择性杀伤的原因之一。在异基因造血干细胞移植中利用 NK 细胞对 iDC 的杀伤清除能力, 输入 KIR/HLA 错配的 NK 细胞可能做为一种安全有效的过继细胞免疫治疗方法用于白血病的治疗, 降低 GVHD 的发生。本研究发现 NKG2D 配体在 iDC表面表达, 并首次证实它直接影响 NK 细胞对 iDC 的选择性杀伤, 为临床造血干细胞移植合理选择供者提供了一定的理论依据。【参考文献】1 Moretta L, Ferlazzo G, Bottino C, et al. Effector and regulatory
26、 events during natural killer-dendritic cell interactionsJ. Immunological Reviews, 2006, 214（10）: 219-228.2 Ruggeri L, Mancusi A, Burchielli E, et al. Natural killer cell alloreactivity and haplo-identical hematopoietic transplantationJ. Cytotherapy, 2006, 8(6): 554-558.3 Ruggeri L, Capanni M, Urban
27、i E, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplantsJ. Sience, 2002, 295(5562): 2097-2100.4 梅家转, 周 健, 郭坤元, 等. 低表达 MICA/MICB 导致 NK 细胞对人鼻咽癌多药耐药细胞（CNE2/DDP）杀伤活性下降J. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2006, 13（5）: 349-352.5 Capobianco A, Rovere-Querini P, Rugarli C, et
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