1、短发夹 RNA 沉默 hTERT 基因抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的实验研究作者：孙卫东 于如同 马衍刚 【摘要】 目的 研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹RNA（shRNA）对裸鼠人脑胶质瘤中 hTERT 基因表达的抑制作用，以及影响肿瘤增殖并诱导细胞凋亡的作用,为脑胶质瘤的基因治疗探讨新的依据。方法 体外培养人脑胶质瘤 U251 细胞株，建立人脑胶质瘤裸鼠皮下接种模型。将成功造模的 36 只裸鼠随机分为 3 组（每组 12 只） 。hTERT shRNA 组肿瘤体内原位注射 hTERT 质粒 shRNA（pshRNA）20 g+脂质体60 l+PBS；PBS 组肿瘤体内原位注射
2、PBS 150 l；空质粒组肿瘤体内原位注射空质粒 20 g+脂质体 60 l+PBS。观察肿瘤生长情况。苏木精-伊红染色观察肿瘤组织的病理改变，Western blot 检测 hTERT 蛋白的表达，钙依赖性磷脂结合蛋白 V+碘化丙啶双染流式细胞仪测凋亡率。结果 成功建立稳定的裸鼠 U251 细胞皮下移植瘤模型。治疗 5 周后 hTERT shRNA 组肿瘤体积较 PBS 组和空质粒组明显缩小，抑瘤率为 58.2%；病理学检查 hTERT shRNA 组肿瘤生长受到抑制，肿瘤细胞散在稀疏，可见大量肿瘤细胞坏死及凋亡；Western blot 示 hTERT shRNA 组 hTERT 蛋白表
3、达受抑制；流式细胞仪检测 hTERT shRNA 组肿瘤细胞凋亡率明显高于 PBS组和空质粒组（P0.01） 。结论 hTERT shRNA 可在裸鼠移植瘤体内有效发挥作用，抑制人端粒酶逆转录酶蛋白在体内表达，从而能有效抑制裸鼠胶质瘤增殖生长,促进肿瘤细胞凋亡。 【关键词】 徐州医学院附属医院神经外科，江苏 徐州 221002 Abstract： Objective To explore the inhibitory effect of silencing human telomerase reverse transcriptase (hTERT) genes short hairpin RN
4、As (shRNAs) on the growth of human glioma in nude mice by RNA interference technique to afford an experimental basis for concerned gene therapy of glioma. Methods Human glioma U251 cells, cultured in vitro, were used to establish models of human glioma by subcutaneous injection into nude mice. The 3
5、6 mouse models formed were divided into 3 groups for varied purposes (n=12 each): the hTERT shRNA therapy group was given in situ injection of hTERT shRNAD plamid (pshRNA) 20 g + lipid 60 l + PBS; the PBS group, given that of PBS 150 l; the blank plasmid group, given that of blank plasmid 20 g + lip
6、id 60 l + PBS. H-E stained specimens of the xenograft tumor were prepared for pathohistological study after the plasmid therapy, Western blot method was used to determoine the protein level of hTERT, flow cytometry was for assessing the apoptosis of tumor cells. Results Satisfactory subcutaneous xen
7、ograft glioma model of nude mice could be constructed within 15 days, with an average size of 132 mm3. Compared with that in the blank plasmid and PBS groups, the tumor growth in the therapy group was evidently depressed down to 58.2%. Through light microscopy, it was found in the hTERT shRNA group
8、that the tumor growth was inhibited obviously, there were relatively few tumor cells, but there were numbers of necrotic and apoptotic tumor cells everywhere. Western blot showed the expression of hTERT protein was restrained. Flow cytometry showed the apoptosis ratio of the tumor was higher in hTER
9、T shRNA group than in the control groups. The differences in these indexes were very significant between the therapy group and the control groups（P0.01）. Conclusion hTERT shRNA can inhibit the transcription and translation level of hTERT in the xenografted glioma in nude mice, inhibiting effectively
10、 the tumor growth and accelerating the apoptosis of tumor cells. Key words： RNA interference (RNAi); human telomerase reverse transcriptase (hTERT); brain neoplasms; glioma; gene therapy 脑胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤，占颅内肿瘤的 35.26%60.96%，目前尚无根治方法。随着分子生物学的迅速发展，从基因水平揭示肿瘤发生、发展机制，寻找有效的基因治疗策略已成为脑胶质瘤研究的热点。目前，脑胶质瘤的基因治疗主要采用
11、自杀基因、抑癌基因、细胞因子免疫基因、反义基因等方法。近年来 RNA 干扰（RNAi）现象的发现1及应用给脑胶质瘤的基因治疗策略带来强烈影响，选择合适的靶基因是RNAi 治疗的关键。鉴于端粒酶在恶性脑胶质瘤中高表达，而端粒酶的激活有永生化细胞和维持端粒长度并阻止恶性细胞死亡的特性，人端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达是端粒酶活性表达中的限速步骤2 。本研究拟在建立裸鼠人脑胶质瘤皮下动物模型的基础上，以 hTERT 基因为靶基因，通过 RNAi 技术抑制其在人脑胶质瘤细胞系 U251 上的表达，从而抑制 U251 细胞的增殖，促进其凋亡，抑制肿瘤生长，为脑胶质瘤基因治疗的临床应用提供实验依据。
12、1 材料和方法 1.1 药品与试剂 根据 hTERT 的 cDNA 序列，构建表达 hTERT mRNA特异的短发夹 RNA（shRNA）真核表达质粒 shRNA（pshRNA,本实验室已前期完成此工作，另文发表） 。用 QIAGEN Plasmid Maxi Kit 大提质粒（依其操作手册工作） 。对获得的质粒 hTERT pshRNA 用 DNA 分析仪测光密度值（D 值）并定量，再做酶切鉴定及测序。RPMI-1640 培养基、SiPORT XP-1 脂质体为 Gibco 公司产品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，Annexin V-FITC 试剂盒购自上海晶美公司，hTERT 抗体购自 S
13、anta Crus公司。 1.2 细胞培养 U251 细胞根据 Gibco BRL 公司的细胞培养手册在无菌层流超净工作台上完成细胞培养和传代后，将 U251 细胞接种于细胞培养瓶中，培养基为 RPMI-1640，加 10%胎牛血清，并加入青霉素、链霉素各 100 mg/L。培养条件：37、5%CO2 培养箱，饱和湿度。倒置显微镜下观察，细胞处于 80%90%融合阶段时进行传代培养，一般 23 天传代1 次。0.05%胰酶消化，0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS)洗除胰酶，取其中 1 l 在光镜下用计数玻片计数，调整比率制成所需细胞悬液，以备种植。 1.3 实验动物分组及裸鼠人脑胶质瘤
14、移植瘤模型的制备 46 周龄雄性裸小鼠（BALB/c nude） 40 只，体重 1822 g，购于复旦大学医学院实验动物中心，饲养于 SPF 级无菌饲养室。收集 U251 细胞，计数细胞数约 5106 /只（鼠） ，加入 0.3 ml 无血清无抗生素 RPMI-1640 培养液中制成细胞悬液，经微量注射器注入裸鼠左侧背部皮下，每 2 天观察肿瘤生成情况并用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积的计算方法参照公式：体积(mm3)ab2 /2，其中 a 代表肿瘤长径，而 b 则代表与 a 最大径垂直的宽度值（短径） 。共成功建立皮下肿瘤模型 36 只，其余 4 只由于技术和细胞状态原因或其他原因导致肿瘤
15、未生成而从实验中剔除。36 只肿瘤模型随机分成 3 组，每组 12 只：PBS 对照组（简称 PBS 组，下同） ，肿瘤体内原位注射 PBS 150 l；脂质体包载的空质粒组（简称空质粒组，下同） ，肿瘤体内原位注射空质粒 20 g+脂质体 60 l+PBS；hTERT shRNA 组，肿瘤体内原位注射 hTERT pshRNA 20 g+脂质体 60 l+PBS。以上各组给药液体总量均为 150 l。 1.4 给药治疗方法 种植 U251 细胞后，待肿瘤增殖至 100150 mm3 大小，采用肿瘤体内原位给药方法：将皮下肿瘤分为 4 个象限，药物分为 4 份注射，给药部位波及瘤体周边反应带处
16、。每 72 h 给药 1 次，共5 次。 1.5 动物移植肿瘤取材和肿瘤标本切片 裸鼠在治疗后第 5 周末断颈处死，取出肿瘤，测量肿瘤体积，计算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-实验组平均瘤体积/PBS 对照组平均瘤体积）100%。将新鲜肿瘤标本留作凋亡检测，余放至液氮保存。标本固定后，经石蜡包埋切片，采用常规苏木精-伊红染色，在光镜下观察肿瘤细胞形态、坏死、凋亡等改变。 1.6 hTERT 蛋白的 Western blot 检测 从液氮取出肿瘤标本，切成小块后充分碾碎，均匀浸泡于适量的 SDS-loading 缓冲液中，置于 4冷室，裂解 30 min。超声仪破碎后，离心。取上清 50 l 加上样
17、缓冲液10 l，95煮样 8 min。等量蛋白上样于 8%SDS-PAGE 胶进行垂直电泳。以湿转法电转移至醋酸纤维素膜（NC 膜）上，后 NC 膜经 3%牛血清白蛋白室温封闭 3 h,加入适当稀释的一抗，4过夜。用 buffer 洗膜 3 遍，加入相应二抗，37反应 2 h,洗膜，以氮四唑蓝（NBT）/5-溴-4-氟-3-吲哚磷酸（BCIP）显色，水洗终止反应。结果以图像处理仪分析处理，计算 D 值。 1.7 细胞凋亡检测 取新鲜肿瘤组织，用剪刀将组织剪成 34 mm大小的碎块。用 Hank 液洗涤，加 0.25%胰酶孵育肿瘤组织。后加入全培养基于组织中，吹打，用不锈钢的筛网过滤细胞悬液。去
18、离子水按 14稀释结合缓冲液，用 250 l 结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1109 个/L。取 100 l 的细胞悬液于 5 ml 流式管中，加入 5 l Annexin V-FITC 和 10 l 20 mg/L 碘化丙啶溶液。混匀后于室温避光孵育 15 min。在反应管中加 400 l PBS，流式细胞仪分析正常细胞、凋亡细胞、机械损伤细胞和死亡细胞百分率。 1.8 统计学处理 实验数据采用 Microsoft Excel 及 SPSS 11.0统计软件分析，计量数据以 xs 表示，采用完全随机设计方差分析法进行统计学分析。检验水准：=0.05。 2 结 果 2.1 hTERT s
19、hRNA 对裸鼠 U251 移植瘤增殖的影响 裸鼠背部皮下注射 U251 细胞后第 810 天出现可触及且肉眼可见的肿瘤组织。种植 U251细胞约 15 天后，裸鼠移植瘤增殖至（132.516.4）mm3。瘤体内原位给药后，hTERT shRNA 组肿瘤增殖明显比同期 PBS 组或空质粒组肿瘤增殖幅度小，空质粒组与 PBS 组比较差异无显著性（P0.05） 。第 5 周末hTERT shRNA 组肿瘤体积明显小于其他各组，抑瘤率达 58.2%。到疗程结束时，荷瘤鼠无一死亡，肿瘤无其他部位转移。见表 1。表 1 治疗后第5 周末不同因素处理后裸鼠肿瘤体积大小及抑瘤率比较 2.2 病理学检查结果
20、苏木精-伊红染色可见 PBS 组和空质粒组肿瘤细胞生长良好，肿瘤细胞形状不规则，分布密集，可见病理性核分裂，少见坏死灶，血供较丰富；hTERT shRNA 组肿瘤内出现较多片状坏死区，肿瘤细胞稀疏散在（图 14） 。图 1 PBS 组移植瘤病理切片 2.3 HIF-1 和 hTERT 蛋白检测结果 取药物治疗后肿瘤组织作hTERT Western blot 检测， PBS 组作为对照组，以 -actin 作为内对照，与空质粒组和 PBS 组比较，hTERT shRNA 组对移植瘤细胞 hTERT 蛋白抑制作用较强（P0.01） ，空质粒组与 PBS 组相比无抑制作用（P0.05） 。见表 2。
21、表 2 各组移植瘤细胞 hTERT 蛋白表达 2.4 移植瘤细胞凋亡检测结果 各组均可见 Annexin V-FITC 单染的凋亡细胞，与 PBS 组和空质粒组比较，hTERT shRNA 组肿瘤细胞凋亡率均明显增高（P0.01） ，而 PBS 组和空质粒组比较凋亡率差异无显著性（P0.05） 。表 3 各组移植瘤细胞凋亡的检测结果 3 讨 论 脑胶质瘤是多基因、多因素参与的神经系统疾病, 其危害性高且不易早期发现，传统治疗方法效果均不理想，基因治疗提供了一条新的思路。寻找这些多因素在脑胶质瘤发生及发展过程中的“共同通道” ，并以此为靶点进行有效治疗是当今基因治疗的发展方向。本实验利用 RNA
22、i 的特性使用 hTERT shRNA 质粒来达到抑制脑胶质瘤生长的目的。RNAi 是细胞本身固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护程序，是双链 RNA分子在 mRNA 水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默的过程。该过程首先由 Rnase 样的 Dicer 酶将双链 RNA（dsRNA）加工成小干扰RNA(siRNA)，接着 siRNA 识别 RNA 诱导的沉默复合物并与之结合，降解底物 mRNA。这些降解的产物又可以与 siRNA 的反义链结合，引起新一轮相对应的 mRNA 降解3 。RNAi 具有高特异性、高效性、高稳定性和高穿透性等。此外，RNAi 尚有激发包括干扰素在内的多种非特异性
23、抗肿瘤反应以及可以传递给子一代等特点4 。 但是，直接向细胞内导入 siRNA 存在基因沉默维持时间短、体内运载难和转染效果不稳定等问题，因此限制了该技术的应用。而利用载体介导的 RNA 技术将有望克服上述困难5 。鉴于此，本研究通过先在体外构建能表达 shRNA 的载体，再将载体转移到肿瘤细胞内并在其内转录后生成 siRNA。载体能够在肿瘤细胞中长期稳定表达，siRNA 亦能够长时间发挥阻断基因的作用。 在前期体外实验中，我们证实 RNA 干扰能抑制体外培养的 U251细胞 hTERT mRNA 及其蛋白的表达，从而抑制端粒酶活性，进而抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡。本实验分别根据 hTERT
24、的 cDNA 序列构建表达hTERT mRNA 特异的 shRNA 真核表达质粒 pshRNA，建立裸鼠皮下人 U251脑胶质瘤模型，将 pshRNA 通过脂质体包裹的方法转染入荷瘤裸鼠瘤体内，观察 RNA 干扰 hTERT 基因抑制肿瘤生长的效果。结果证实：给予 shRNA质粒后，肿瘤的生长受到明显抑制，治疗结束时 hTERT shRNA 组肿瘤体积较 PBS 组和空质粒组明显减小，抑瘤率为 58.2%，说明 RNAi 治疗脑胶质瘤能有效抑制肿瘤增殖。 通过肿瘤的病理学检查及凋亡检测，发现给予 hTERT shRNA 质粒的裸鼠肿瘤组织出现肿瘤细胞稀疏散在，出现多发大片坏死灶，而空质粒组和
25、PBS 组肿瘤细胞生长密集，细胞核分裂多见，坏死区少见。hTERT shRNA 组凋亡率为（12.321.43），而空质粒组和 PBS 组凋亡率分别为（4.320.58）、 （2.280.26），差异显著。产生这种作用的机制可能是：pshRNA 表达了特异性 shRNA，从而选择性降解了 hTERT mRNA，导致 hTERT 蛋白合成减少，引起端粒酶活性下降。端粒酶活性下降后，端粒较短的癌细胞因端粒未得到及时的补充，细胞增殖能力下降，从而发生凋亡及死亡。这与 Western blot 证实的 shRNA 质粒表达可下调hTERT 蛋白水平的结果相一致。 总之，这次 shRNA 干扰治疗实验取
26、得初步成效,为以后临床 RNAi治疗脑胶质瘤提供一定实验依据。随着对 RNAi 作用机制以及脑胶质瘤分子遗传学研究的深入，针对脑胶质瘤中不同靶基因的 RNAi 治疗将会有更广阔的应用前景。 【参考文献】 1 Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and sepecific genetic interference by doule stranded RNA in caenorhabditis elegansJ. Nature,1998, 391(6669):8063-8067. 2 Tollefsbol TO, Andrews LG. Mecha
27、nisms for telomerase gene control in aging cells and tumorigenesis J. Med Hypotheses, 2001,56(6): 630-637. 3 Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, et al. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interferenceJ. Nature, 2001, 409(6818):363-366. 4 Svoboda P, Stein P, Hayashi H, et al. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interferenceJ. Development, 2000, 127(19): 4147-4156. 5 Brummelkamp TR， Bernards R， Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cellsJ. Science， 2002, 296(5567):550-553.
