1、肝癌生长、转移中的微血管生成机制作者：李海民 赵爱志 窦科峰 李开宗 付由池 【关键词】 肿瘤转移, 关键词: 癌，肝细胞;毛细血管;肿瘤转移 摘 要:目的 研究微血管生成在肝癌、肝硬化、正常肝间的差异及其与肝癌生长、转移、病理特点的关系. 方法 用因子抗体和 APA 试剂盒对 45 例肝癌、21 例肝硬化和 8 例正常肝的标本行免疫组织化学染色，然后在 200（）显微镜下计数每一视野下的微血管数目. 结果 肝癌、肝硬化、正常肝组织的微血管数目分别是 67.423.8，14.45.8 和3.52.0，经统计学分析，三者相差显著（P0.01） ，微血管数与肝癌的转移、包膜形成相关，而与肝癌的大小
2、、分级无关. 结论 微血管生成在肝癌的转移、包膜形成中具有重要的作用. Abstract:AIM To investigate the difference and the mecha-nism of angiogenesis among hepatocellular carcinoma（HCC） ，cirrhosis and normal liver.METHODS With antibody offactor and APA kit，paraffin-embedded slides of45HCC，21cirrhosis and8normal liver were stainned，aft
3、er which，mi-crovessel counting was performed.RESULTS The mi-crovessel density（MVD）of HCC，cirrhosis and normal liver was67.423.8，14.45.8and3.52.0respectively.The difference was significant statistically.The MVD was corre-lated with the metastasis and capsule formation of HCC.CONCLUSION Angiogenesis m
4、ay play an important role in the metastasis and capsule formation of HCC. 0 引言 肿瘤的血管生成被认为是一个小的突变细胞群转化为一个大的、呈恶性生长并具有扩散和转移能力的肿瘤的一个关键步骤1 .现在肿瘤的血管新生已被作为一个预后指标广泛用于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌等2-7 肿瘤的研究，然而血管新生与肝癌病理特点，与正常肝和肝硬化之间的关系的研究，迄今为止很少.我们知道，肝癌是一个高血管质的肿瘤，恶性程度较高，在血管造影中，肝癌大多表现出高血管质的特点，因而，研究肝癌的血管生成与肝癌的发展、浸润、转移
5、及预后的关系将有重大意义. 1 材料和方法 1.1 材料 因子抗体和 APA 试剂盒购自武汉博士德公司，45 例肝癌标本和 21 例肝硬化标本均取自 1994/1997 年西京医院手术切除、病理诊断明确的标本，正常肝标本取自尸检标本，常规连续切片，厚度0.5m. 1.2 方法 采用卵白素-生物素（SABC）-过氧化酶免疫组织化学染色，操作步骤按试剂盒说明.结果判定微血管呈棕黄色，计数按 Herbst等3 人的方法进行微血管计数（microvessel density，MVD） ，由两个人用双筒显微镜进行计数，所要计数的微血管标准是:与临近微血管或其连续组织分离的、阳性着色的内皮细胞或内皮细胞丛
6、被认为是一个独立的可被计数的微血管.先用低倍镜（50）浏览整个切片，找出微血管密度最高的 3 个区域，再在这 3 个区域中用高倍镜（200）随机各选取1 个高倍视野，行镜下计数每一个高倍视野下的微血管数目，由两个人各计数的 3 个高倍视野的微血管数取其平均值，此值代表整块组织的微血管数，具有厚肌层的未被免疫组化着色的大血管，不在计数之列. 统计学处理:数据以 x s 表示，采用 t 检验. 2 结果 2.1 微血管密度与肝细胞肝癌病理特点之间的关系 肝癌内微血管密度较高，微血管主要分布在肿瘤内部（Fig1） ，由此可见，肝癌是一种高血管质的肿瘤.一般来说，高密度区集中于肿瘤近周边或近包膜处.坏
7、死组织周围微血管密度也较高，而肿瘤的中心及瘤外肝组织分布较少.微血管数波动于 18121（67.423.8）之间.微血管密度与包膜形成显著相关，有包膜的肿瘤较无包膜的肿瘤具有较高的微血管密度.（t=1.84，P0.05）.本实验还提示微血管密度与肿瘤的转移（包括肝内转移，门静脉侵犯或肝外远处转移）显著相关.发生转移的肿瘤，不论其体积大小，分化程度如何，有无包膜形成，均有较高的微血管密度.本研究提示在许多微血管中有单个或多个癌细胞侵犯，有的癌细胞恰好处于侵犯微血管壁的过程中（Fig2）.未发现微血管密度与肿瘤大小、分化程度之间的相关性（Tab1）. 图 1 图 2 略 2.2 肝硬化、正常肝中的
8、微血管新生 肝硬化和正 常肝的微血管密度明显减少，比较而言，肝硬化的微血管密度较正常肝高，肝硬化的微血管密度波动于 032.83 之间（14.45.8） ，而正常肝的微血管密度波动于 08.64 之间（3.52.0） ，在肝硬化和正常肝中，微血管一般呈均匀分布，在炎症细胞浸润区，微血管密度相对较高（Tab2）. 表 1 微血管密度与肝癌病理特点的关系 略 表 2 肝癌、肝硬化、正常肝微血管密度的比较 略 3 讨论 对于肿瘤的生长及转移，血管新生是其必要的条件8-11 ，若没有血管新生供给其迅速生长的瘤体以充足的营养，仅靠单纯的组织液扩散的方式维持其营养供应，肿瘤的直径仅能保持在 12mm，若较
9、大的肿瘤一旦失去血液供应，将会坏死、凋亡、处于休眠状态.许多研究表明，肿瘤的血管新生与其浸润、转移的潜能相关.越来越多的证据表明，血管新生的诱导是肿瘤的一个具体的表型特征，是在肿瘤发展的早期，也就是在癌前病变时就已具有的特征，这在转基因鼠肿瘤形成和一些人类肿瘤的发展过程中也得到了证实. 从肿瘤新生血管的结构特点来看，肿瘤的新生血管利于肿瘤的生长、浸润和转移，肿瘤的新生血管一般缺乏完整的血管壁，细胞间连接不紧密，连续性常遭破坏，基底膜不完整，肿瘤细胞容易进入新生血管，这就为肿瘤的浸润和转移创造了便利条件.我们发现有的癌细胞恰好处于侵犯微血管壁的过程中，有的已侵入微血管内，而且有的微血管内可见多个
10、癌细胞，由此可见，微血管的生成在肿瘤的转移中具有不可低估的作用. 肝癌是一种多血管质的肿瘤，可以想象，血管新生对其生存、发展是很重要的.然而，近年来对血管新生与肿瘤关系方面的研究多集中在黑色素瘤、乳腺癌、直肠癌等肿瘤，而对肝癌的研究甚少.我们的研究发现，血管新生与肝癌的转移显著相关（P0.05） ，肝癌的转移包括肝内转移，门静脉侵犯及肝外远处转移，而最多见的是肝内转移.肝内转移可通过肝内寄存于门静脉、肝动脉分支形成，而新生血管的结构缺陷不仅为其肝内转移提供了便利的途径，而且为其肝外转移打开了门户.有研究表明，肝癌的肝内转移与其血管新生相关12 ，但对其机制的研究仅限于假说，有待进一步的研究阐明
11、. 实体肿瘤是由肿瘤细胞和间质两部分组成的，血管就分布于间质中.所以，间质在肿瘤中的作用不仅仅是连接，更重要的是供给肿瘤以血液，使肿瘤细胞可以得到充足的养分，有效的气体交换和废物排出.纤维蛋白是形成间质的前体，间质的形成过程是肉芽组织以及随后的成熟间质逐渐代替纤维蛋白的过程.肿瘤细胞是不能产生纤维蛋白原的，所以，血管外纤维蛋白的沉积是来源于具有高度通透性的微血管，而肿瘤的新生微血管由于其结构上的不完整性以及一些细胞因子（如 VEGF）的作用而具有了高通透性的特点.因而微血管的高通透性被认为是肿瘤中纤维蛋白沉积的主要原因之一13 .本研究中，近包膜区的微血管密度较高，与包膜形成显著相关.肝癌包膜
12、形成的机制尚未阐明，有人认为包膜是肿瘤的生长压迫周围间质而形成的14 .然而，这一假说受到了质疑，因为肝癌的大小与包膜的形成及包膜的厚度均无关15 .这些发现提示，肿瘤包膜形成的原因更可能是纤维蛋白的外渗而不是肿瘤生长对周围间质的压迫. 我们的研究为微血管的高通透性在肝癌包膜形成中 的地位提供了有力的证据. 靠近周边部的微血管密度较高，其机制尚不清楚，可能与肝癌的浸润有关，高密度的微血管能给周边癌细胞提供更充足的养分，这就更加强了其浸润能力.由于肿瘤的迅速生长，处于中心部位的肝癌细胞较周边部位的肝癌细胞受到更大的压力，所以，周边部位的肝癌细胞所处的宽松环境不仅有利于血管自寄存的血管床上萌芽、生
13、长，而且为微血管新生所需的诱导因子在这种宽松环境下易于受趋化而到达血管新生部位创造了条件.所以，血管新生、肿瘤迅速生长、浸润是相辅相成的.肝癌的浸润可能需要微血管的支持，以提供营养或其他必要的细胞因子以降解基质，破坏正常肝细胞，这可能是微血管高密度区位于肿瘤周边的一个原因.在坏死灶周边，微血管密度相对增高，这可能与坏死后缺氧有关.目前已知缺氧可触发血管生成因子的释放，诱导微血管生成.然而在肝癌的中心部位，微血管密度较低，从这一现象来看，缺氧在肝癌微血管新生中的地位可能不是主要的.因为生物动力学研究表明，由于肿瘤的迅速生长，其中心部位的压力较大，细胞也较密集，相对于外周的癌细胞来说，缺氧更趋严重
14、，而处于周边部的肿瘤细胞，不仅所受压力小，细胞较松散，而且可以从瘤外弥散过来的组织液中获取营养，所以其缺氧程度相对较轻，而实际情况是中心部位的微血管密度较低，而周边部相对较高.这说明，肝癌血管新生的调控是非常复杂的，由多种促血管生成因子、抑血管生成因子以及其他许多尚未确定的因素的参与，如肿瘤中心缺乏淋巴引流、代谢物不易排出、pH 降低等.在肝癌血管新生的复杂调控中，缺氧所占的比重可能是很小的或其力量的发挥受到其他因素的制约.肝癌中心的高压力一方面可造成缺氧，另一方面，它可能会剥夺新生血管自寄存血管萌芽所需要的宽松的低压力环境，所以肿瘤中心的高压力引起的直接后果可能不是血管新生诱因之一的缺氧，而
15、是从生物动力学上抑制了虽有缺氧等其他因素诱导的血管新生.当中心部位出现坏死，溶解后，坏死周边压力降低，加之缺氧和其他诱导血管生成因子的参与下才出现了微血管的新生，并呈较高密度，所以在肝癌的血管新生中，压力因素可能较缺氧因素发挥着更重要的作用. 另外，在肝硬化标本中微血管密度较肝癌显著降低，而高于正常肝.国内的肝硬化大多伴有乙型或丙型肝炎，炎症介质中包含有许多可以直接诱导血管新生的细胞因子，如 IL-8，TNF-，TGF，bFGF，VEGF 等，这些因子还可间接地或诱发其他更强的促血管生成因子而协同作用于微血管的生成.而且肝硬化存在广泛的纤维化，血管经纤维条索压迫后扭曲，血运不畅，肝血窦受压，所
16、以与正常肝相比，存在缺氧情况，肝硬化炎症介质的释放，细胞因子的作用及缺氧共同促成了微血管的新生.这可以说明，在肝硬化、正常肝中，微血管多集中在炎症细胞聚集的区域.就国内而言，肝癌多伴有肝硬化，而若肝硬化的微血管密度在某个区域显著升高，则可能是下一步癌变的前奏，由原位癌到浸润癌的发展必须克服的一个难关就是微血管新生. 从本研究可以看出，微血管生成与肝癌的转移、浸润有关，而与肿瘤的分级、大小无关，现在对这方面的研究在国外也才刚起步，得出的结果往往不太相符，其具体原因有待进一步阐明.彻底弄清微血管生成与肿瘤病理特点之间的关系必将为肿瘤的抗血管治疗提供新的理论依据. 参考文献: 1Folkman J.
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