1、环氧氯丙烷处理对生物瓣膜及组织工程瓣膜材料表面性状的影响【关键词】 血小板粘附 【Abstract】 AIM: To define the surface characteristics of porcine valvular tissue and tissueengineering bioprostheses material treated with epoxy chloropropan so as to elucidate the mechanism involved in the mitigation. METHODS: The surface characteristics of p
2、orcine valvular tissue and acellular tissueengineering bioprostheses material treated with epoxy chloropropan were evaluated by measuring the plasma protein adsorption and platelet adhesion in vitro. Fresh porcine valves and porcine valves treated with glutaraldehyde were tested as control. RESULTS:
3、 Porcine valvular tissue treated with epoxy chloropropan showed lower plasma protein adsorption (0.1200.008） g/kg vs (0.1830.017) g/kg， P0.05) and platelet adhesion (1.1580.120) 1012/kg vs (1.7370.093)1012/kg， P0.05 in vitro as compared to those of control. Acellular porcine valve demonstrated lower
4、 plasma protein adsorption （0.1160.013) g/kg vs (0.1340.011) g/kg， P0.05 and platelet adhesion （0.7690.136) 1012/kg vs (1.0520.185)1012/kg， P0.05 in vitro as compared to those of fresh porcine valve. Epoxy chloropropan treatment further reduced the plasma protein adsorption （0.1020.004) g/kg vs (0.1
5、160.013) g/kg， P0.05 and platelet adhesion （0.7440.097) 1012/kg vs (0.7690.136)1012/kg， P0.05. CONCLUSION: Porcine valvular tissue and acellular tissueengineering bioprostheses material treated with epoxy chloropropan have better surface characteristics and blood compatibility, which may be useful f
6、or mitigating calcification. 【Keywords】 heart valve prosthesis; epoxy chloropropane; protein adsorption; platelet adhesiveness 【摘要】 目的： 研究环氧氯丙烷（EC）处理对生物瓣膜及组织工程瓣膜去细胞支架材料表面性状的影响，探究 EC处理生物瓣膜防钙化的机制. 方法: 通过血浆吸附试验和血小板吸附试验测定 EC处理的猪主动脉瓣以及经去细胞处理的组织工程猪瓣支架材料对血浆中蛋白质和血小板的吸附程度，与戊二醛处理的生物材料进行对照研究，评价 EC处理对生物材料的表面性状的
7、影响 结果: EC处理的生物瓣膜较戊二醛处理的生物瓣膜对血浆蛋白质吸附率减少（0.1200.008) g/kg vs (0.1830.017) g/kg, P0.05 ，血小板黏附率减少（1.1580.120) 1012/kg vs (1.7370.093)1012/kg, P0.05 ，对猪主动脉瓣去细胞处理过程能够减少血浆蛋白质吸附率（0.1160.013) g/kg vs (0.1340.011) g/kg, P0.05和血小板黏附率（0.7690.136) 1012/kg vs (1.0520.185)1012/kg, P0.05 ，EC 处理能够进一步减少血浆蛋白质吸附率（0.102
8、0.004) g/kg vs (0.1160.013) g/kg, P0.05和血小板黏附率（0.7440.097) 1012/kg vs (0.7690.136)1012/kg, P0.05 结论 : EC处理能够进一步改善生物瓣膜和组织工程瓣膜去细胞支架材料的表面性能，有利于提高植入循环系统后的血液相容性和减缓瓣膜钙化 【关键词】 心脏瓣膜，人工；环氧氯丙烷；蛋白质吸附；血小板粘附 0 引言 生物心脏瓣膜植入人体后对血浆中蛋白质和血小板的过多吸附容易引起血栓形成以及瓣膜的钙化，影响瓣膜的使用寿命，因此，生物瓣膜的表面性状是评价瓣膜质量的重要指标之一环氧氯丙烷（epoxy chloropro
9、pan, EC）是经筛选的生物瓣膜防钙化剂，动物实验证明 EC能使戊二醛处理的瓣膜钙化明显减轻，仅为对照组的 1/317，且瓣膜的力学性能和组织稳定性良好EC 处理的猪瓣（XJ 猪瓣）临床应用 300余例，随访 15 a，未发现钙化，使用寿命长1,2 在组织工程瓣膜研究中，应用 EC处理去细胞猪瓣支架材料毒性低,初步实验研究种子细胞能够生长. 我们对 EC处理的生物瓣膜及组织工程瓣膜去细胞支架材料的表面性状通过血浆吸附试验和血小板吸附试验予以评价 1 材料和方法 11 材料瓣膜来自正常成年猪主动脉瓣，热缺血时间在 2 h以内，置入 4 PBS溶液中保存. 血浆和血小板来源于西安第四军医大学西京
10、医院血库，解冻后 3 d内使用. 12 方法 去细胞处理： PBS溶液中漂洗 2次， 10 min/次，置入 Triton X100溶液中 12 h， 1 g/L胰蛋白酶消化 3 min， PBS溶液中漂洗 2次，10 min/次，4PBS 溶液中保存; EC 处理: 瓣膜修剪后，置入 3 mL/L戊二醛溶液中处理 48 h，PBS 溶液中漂洗 2次后，置入 2 mL/L环氧氯丙烷溶液中 48 h均为室温条件; 血浆蛋白吸附试验： 实验共分 6组，新鲜猪瓣组，EC 处理的猪瓣组，戊二醛处理的猪瓣组，戊二醛加 EC联合处理的猪瓣组，去细胞组织工程猪瓣组，EC 处理的去细胞组织工程猪瓣组，每组瓣膜
11、各 10例各组瓣膜 PBS漂洗 3次，5 min/次，置入 10 mL血浆中 37振荡 3 d，取出后再漂洗 3次，5 min/次，标本冻干测定质量后剪碎匀浆，置于 Tris Buffer（14 mmol/L Tris, 120 mmol/L NaCl，3 mmol/L KCl，pH 7.4）4, 2 min，12 000 g离心，4, 30 min，采用 Bradford方法测定上清蛋白质浓度蛋白质吸附率吸附的蛋白质（g）/瓣膜质量（mg）; 血小板吸附试验： 分组情况同血浆蛋白吸附试验，各组瓣膜 PBS漂洗 3次，5 min/次，置入 10 mL富含血小板的血浆中 37，3 h，血浆在标本
12、放入前和取出后分别用血小板计数仪测量血小板计数，血小板黏附率（富含血小板血浆中的血小板数-标本黏附后残留血浆中的血小板数）/瓣膜质量（mg）. 统计学处理： 实验结果以 xs表示，应用 SPSS10.0软件进行处理，经方差齐性检验，血小板黏附率各组之间方差平齐，则采用单因素方差分析，组间比较用 SNK法；由于血浆蛋白吸附率各组之间方差不齐，故采用多个样本比较的非参数检验 KruskalWallis方法比较，P0.05，表示差异有统计学意义. 2 结果 经戊二醛处理的生物瓣膜蛋白质吸附率较新鲜瓣膜组高，而经 EC处理后蛋白质吸附率明显下降. 去细胞瓣膜组较新鲜瓣膜组蛋白质吸附率明显下降, 经 E
13、C处理后去细胞瓣膜组蛋白质吸附率进一步下降. 血小板黏附试验显示戊二醛处理的生物瓣膜血小板黏附率较新鲜瓣膜组高，而经 EC处理后血小板黏附率明显下降. 去细胞瓣膜组和经 EC处理后去细胞瓣膜组较新鲜瓣膜组血小板黏附率明显下降(Tab 1) .表 1血浆蛋白吸附率及血小板黏附率（略） 3 讨论 人工瓣膜是一种植入人体后与血液密切接触的人工装置，全世界每年超过 175 000个人工心脏瓣膜应用于临床，目前无论机械瓣还是生物瓣均未达到理想程度3,4 生物瓣和目前的研究热点组织工程生物心脏瓣膜为中心血流型，无需终生抗凝，但长期植入人体后的钙化使其易于衰坏5-7. EC化学改性生物瓣膜的方法实验证明具有
14、显著的防钙化作用1,2 然而 EC处理对生物瓣膜和组织工程瓣膜去细胞支架材料表面性状的影响尚未有实验研究 当血液和人工装置表面接触时，机体凝血系统会产生一系列的反应，人工装置的表面会迅速吸附血浆蛋白，进一步引起血栓的形成血浆蛋白吸附的多少主要取决于人工装置的表面性状和机体的自身的血凝状态纤维蛋白原是主要吸附的蛋白质，其他的血浆蛋白有： 白蛋白、球蛋白等血小板的黏附继发于血浆蛋白吸附之后，这一过程是血小板膜黏蛋白（platelet membrane glycprotein） 、血浆 von Willebrand因子（vWF）等参与和相互作用的结果 黏附过程包括： 吸附、接触、附着、扩展 4个过程
15、，它是一个血小板重要的在体内、体外均具有的特征性功能，血浆蛋白吸附的多少影响血小板黏附的数量，而两者都影响人工装置表面的血液相容性 因此，血浆蛋白吸附率和血小板黏附率是衡量人工装置表面性状的两个重要指标8 本结果显示戊二醛处理的生物瓣膜蛋白质吸附率和血小板黏附率较新鲜瓣膜组高，而经 EC处理后蛋白质吸附率和血小板黏附率均明显下降分析可能的原因为戊二醛处理后的瓣膜组织含水量下降，蛋白质结构由于其强烈的交联作用而皱缩，使表面结构较为粗糙，而经 EC处理后，组织含水量增加，表面光滑，因而吸附较少的蛋白质和黏附较少的血小板；另一种可能的机制为戊二醛的交联和 EC的改性改变了瓣膜组织中蛋白质侧链基团的结
16、构以及表面的电荷性质，继而影响了对蛋白质和血小板的吸附在实验中，我们发现去细胞猪瓣较新鲜猪瓣蛋白质吸附率和血小板黏附率低，可能是去细胞的过程去除了细胞残骸、脂质、胆固醇等成分，使瓣膜结构以胶原蛋白、弹性蛋白等细胞外基质成分为主，亲水性好，表面结构光滑，因而吸附的血浆蛋白和血小板少，而 EC的处理同样又能进一步改善其表面结构本实验中，血小板黏附率和蛋白质吸附率的结果是一致的，可能是血小板的黏附主要决定于蛋白质的吸附量从本实验的结果可以看出，EC 处理能够进一步改善生物瓣膜和组织工程瓣膜去细胞支架材料的表面性能，有利于提高植入循环系统后的血液相容性和减缓瓣膜钙化，同时对于 EC处理方法在生物瓣研制
17、领域特别是在组织工程瓣膜支架材料的处理中的应用提供了重要的理论依据 【参考文献】 1 易定华，刘维永，王伯云，等. 减轻异种(猪)主动脉瓣钙化的实验研究J. 中华胸心血管外科杂志,1988;4:48-51. Yi DH, Liu WY, Wang BY, et al. Experimental research for alleviating calcification of porcine aortic valve J. Chin J Thorac Cardiovasc Surg, 1988;4:48-51. 2 易定华，刘维永. 生物心脏瓣膜钙化机制及抗钙化研究J. 中华外科杂志,1996
18、;34:631-633. Yi DH, Liu WY. Study for mechanism of heart valve bioprostheses calcification J. Chin J Surg, 1996;34:631-633. 3 Karl H, Gulshan K, William G, et al. Outcomes 15 years after valve replacement with a mechanical versus a bioprosthetic valve: Final report of the veterans affairs randomized
19、 trial J. J Am Coll Cardiol, 2000;36:1152-1158. 4 Eric WR, Michael J, Janusz T, et al. Hemodynamic comparison of secondand thirdgeneration stented bioprostheses in aortic valve replacement J. Ann Thorac Surg, 2001;71:S282-S284. 5 Steitz SA, Speer MY, McKee MD, et al. Osteopontin inhibits mineral dep
20、osition and promotes regression of ectopic calcification J. Am J Pathol, 2002;161(6):2035-2046. 6 Sacks MS, Schoen FJ. Collagen fiber disruption occurs independent of calcification in clinically explanted bioprosthetic heart valves J. J Biomed Mater Res, 2002;62(3):359-371. 7 Meuris B. Research on biological and mechanical heart valves: Experimental studies in chronic animal models J. Verh K Acad Geneeskd Belg Review, 2002; 64(4):287-302. 8 Kyoung SJ, Yong SK, Ki DP, et al. A novel chemical modification of bioprosthetic tissues using Larginine J. Biomaterials, 2003;24:3409-3416.
