1、升清胶囊对豚鼠胆石病相关基因的影响【关键词】 ,胆结石摘要 目的：探讨中药升清胶囊在分子层面防治胆石病的机制。方法：雌性豚鼠 60 只，随机分成正常组（喂正常饮食作为对照） 、模型组（喂低蛋白饮食致石）和中药组（喂低蛋白饮食致石加中药升清胶囊治疗） 。6 周后处死并取材，观察动物成石情况，检测肝组织胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（bilirubin UDPglucuronosyltransferase, BUGT）mRNA 及胆固醇 7 羟化酶(cholesterol 7hydroxylase, CYP7A1)mRNA 表达。结果：各组豚鼠成石比例分别为正常组 2/14、模型组为 9/11
2、、中药组为 4/14，组间有显著差异(P0.05)，正常组和中药组豚鼠的肝组织 BUGT mRNA 及 CYP7A1 mRNA 表达明显高于模型组(P0.05)。结论：中药升清胶囊可能是通过上调肝组织中 BUGT mRNA 和 CYP7A1 mRNA 的表达，干预胆红素和胆固醇代谢，抑制致石性胆汁形成，起到预防胆结石的作用。关键词 胆结石; 升清胶囊; BUGT; 胆固醇 7 羟化酶; 基因Effects of Shengqing Capsules on cholelithiasisrelated genes in guinea pigsABSTRACT Objective: To explo
3、re the molecular mechanisms of Shengqing Capsules in treating cholelithiasis. Methods: Sixty female guinea pigs were randomized into 3 groups: group (fed with normal diet), group (fed with lowprotein diet) and group (fed with lowprotein diet and Shengqing Capsules). After sixweek feeding, the gallst
4、one formation and the expressions of bilirubin UDPglucuronosyltransferase (BUGT) mRNA and cholesterol 7hydroxylase (CYP7A1) mRNA were observed. Results: The proportions of stoneformed in groups , and were 2/14, 9/12 and 4/14, respectively. There were significant differences among the three groups (P
5、0.05). The expressions of BUGT and CYP7A1 mRNAs were higher in both group and group as compared with those in the group (P0.05). Conclusion: Shengqing Capsules can reduce the rate of stoneformation, which may be due to its interference of metabolism of bilirubin and cholesterol and upregulation of t
6、he expressions of BUGT and CYP7A1 mRNAs.KEY WORDS cholelithiasis; Shengqing Capsules; BUGT; cholesterol 7hdroxylase; gene胆石病属中医“胁痛” 、 “黄疸”等范畴，历代医家积累了丰富的治疗经验。作者曾在已故外科专家顾伯华教授和徐长生教授采用疏肝利胆法治疗本病取得较好疗效的经验基础上，总结和开发了治疗肝胆气郁型胆石病的中成药胆宁片。近年，作者又从小复方角度进一步精简胆宁片的药味，研制开发出治疗胆石病的新一代中成药升清胶囊，并在此前的研究中发现该药能从胆石病发病的枢纽环节肝细胞水
7、平阻断致石性病理性胆汁的形成，显著降低实验动物胆色素结石的成石率1 。为进一步探讨升清胶囊在分子层面防治胆石病的机制，开展了以下研究。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物 红目雌性豚鼠，清洁级，共 60 只，体质量250300 g，由上海中医药大学实验动物中心提供。1.1.2 药物 升清胶囊，主要药物组成为大黄、虎杖和陈皮，上海中医药大学龙华医院制剂室提供干粉剂。1.1.3 饲料 正常饲料，由上海申旺实验动物中心提供。造模用致石性饲料，在正常饲料基础上添加致石药物。具体配方为：正常饲料45.43 g，致石性药物 4.57 g（其中酪蛋白 1 g、蔗糖 1.5 g、猪油 1 g、微
8、晶纤维素 1 g、胆酸 0.02 g、胆固醇 0.05 g） 。1.1.4 主要试剂 焦碳酸二乙酯（DEPC） ，脱氧核苷三磷酸（10 mmol/L） ，随机引物（100 mol/L） ，博彩生物技术公司产品；RNA 提取试剂 Trizol，Taq 聚合酶（5 U/l） ，Gibco 公司产品；MMuLV 逆转录酶（200 U/l） ，核糖核酸酶抑制剂（RNAsin，40 U/l） ，Promaga 公司产品；DNA 标记物（100 bp） ，生工生物技术公司产品。豚鼠胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（bilirubin UDPglucuronosyltransferase, BUGT）上游
9、引物(270289, 20 bp): 5ACT GGG CAA CGC TAA GAA GG3 ；下游引物(531512, 20 bp): 5TAT GCC ACA GGG AAC AGA GC3；PCR 产物长度：262 bp。豚鼠胆固醇 7 羟化酶(cholesterol 7hydroxylase, CYP7A1)上游引物(812832, 21 bp): 5GTT TCT CAA TGA CAC GCT CTC3；下游引物(12491229, 21 bp): 5AAA GTC AAA GGG TCT GGG TAG3；PCR 产物长度: 438 bp。豚鼠内参 actin 上游引物(30
10、bp): 5TCA TGA AGT GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG3；下游引物（30 bp）：5GCT AGA AGC ATT TGC GGT GCT CGA TGG AGG3；PCR 产物长度：286 bp。1.1.5 主要仪器 85 /371 L ELTBLV 超低温冰箱，美国Harris 公司；AA200DS 电子天平，美国 GG 公司；匀浆器，美国Wheaton 公司；低温离心机，日本久保田公司；平面电泳仪，LKB 激光灰度扫描仪，瑞典 Pharmacia 公司；LNGT83 真空离心浓缩干燥器，太仓市华美生化仪器厂；DZF3 型干燥箱，上海顿克仪器科技有限公司
11、；DSHZ300型多用途水浴恒温振动器，上海一恒科技有限 公司；X700 型照相机，日本美能达公司；紫外线透射反射仪，北京利康达圣科技发展有限公司；752 分光光度计，上海测维光电技术有限责任公司；DNA Amp Cycler 9600 PCR 热循环仪，9600 型 PCR 基因扩增仪，KS400 型计算机图像分析系统，美国 PerkinElmer 公司。1.2 实验方法1.2.1 造模方法 采用本科室首创的低蛋白致石饮食所致的豚鼠胆结石模型1 。将豚鼠置实验室笼养，每笼 5 只，先喂养正常饲料 1周以适应环境，造模时喂以致石性饲料，造模期间不限饮食量，自由饮水，控制青菜量。1.2.2 动物
12、分组 将 60 只豚鼠随机分为 3 组，即正常对照组（正常组）15 只、致石饲料造模组（模型组）25 只、致石饲料造模并经中药升清胶囊治疗组（中药组）20 只。正常组喂以正常饲料及适量青菜；模型组喂以致石饲料及少量青菜（相当于正常组的 1/10） ；中药组在喂以致石饲料及相当于模型组青菜量的同时，加喂中药升清胶囊，其中正常饲料和致石饲料均不限量。1.2.3 给药方法 先将升清胶囊干粉剂按 89 mg/ml 浓度配制成干粉溶液。中药组按 10 mlkg1d1 喂以升清胶囊干粉溶液。模型组及正常组灌以生理盐水，按 10 mlkg1d1 灌胃。均分 2 次灌胃，连续 6 周。1.2.4 标本采集 用
13、 15乌拉坦以 1 g/kg 剂量腹腔注射麻醉，新洁尔灭酊消毒皮肤后，打开腹腔，抽取后腔静脉血，止血钳钳夹胆囊管，肉眼观察成石情况，用 1 ml 皮试针筒抽取胆汁后充氮，20 避光保存（供生化检测，另文报道） ，完整切除胆囊，剖开，再仔细观察成石情况。取相同部位肝组织约 1 cm1 cm1 cm，用 10%福尔马林固定作光镜检查。从各组中每组随机抽取 5 只，切取 2 mm2 mm2 mm 肝组织，用 2%戊二醛固定，待作电镜观察（另文报道） 。其余肝组织置液氮中保存。1.3 观察指标1.3.1 大体情况及体质量变化 观察各组动物饮食、体质量变化、皮毛光泽度、活动情况及成活率等。1.3.2 胆
14、囊成石率 拨开胆囊，以肉眼观察胆囊内有无胆石或胆泥作为判断动物结石的标准，记录各组动物成石情况。1.3.3 肝组织胆石病相关基因 BUGT 及 CYP7A1 mRNA 表达 依据博彩生物技术公司提供的操作说明，配制相关的实验工作液，并完成组织总 RNA 抽提、RT 反应、PCR、电泳等步骤。随后用 KS400 型图像分析系统对电泳凝胶的底片进行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应样品内参基因光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量，最后以目的基因的相对转录量为参数进行统计分析。1.4 统计学方法 用 SPSS 10.0 进行单因素方差分析，计数资料按 Ridit 法计算 u 值。2 结
15、果2.1 各组豚鼠大体情况 造模过程中正常组死亡 1 只，模型组死亡 14 只，中药治疗组死亡 4 只。模型组豚鼠明显消瘦，皮毛欠光泽，容易脱落，活动迟缓，反应迟钝。治疗组皮毛稍欠光泽，其余情况与模型组大体相似。正常组皮毛欠光泽，反应灵敏，活动敏捷。2.2 各组豚鼠体质量 实验第 1 周，3 组动物的体质量无明显差异，见表 1；经过 6 周的喂养，正常组和中药组动物的体质量明显高于模型组，见表 2 表 1 实验第 1 周时各组豚鼠体质量表 2 实验第 6 周时各组豚鼠体质量2.3 各组豚鼠成石率 动物胆囊所见结石外形不规则，呈棕黑色泥沙样或棕色絮状沉淀。经红外光谱鉴定，为胆红素结石。各组成石率
16、的结果经统计学检验，模型组与正常组和中药组相比均有统计学差异。见表 3。 表 3 各组豚鼠成石率2.4 BUGT 及 CYP7A1 mRNA 表达 中药组动物肝组织 BUGT mRNA和 CYP7A1 mRNA 的表达虽低于正常组，但显著高于模型组。见表 4。表 4 豚鼠肝组织 BUGT 和 CYP7A1 mRNA 表达3 讨 论3.1 升清胶囊在胆色素结石动物模型中具有干预结石形成的作用 本课题组于 1982 年率先在国内建立豚鼠胆色素结石模型，在课题组已完成的多项研究中均证实本实验所采用的胆色素结石造模方法具有成石率高、重复性强的优点2 。本研究发现低蛋白致石饲料喂养 6 周后，模型组豚鼠
17、胆色素结石成石率达到 82%，与正常组比较差异显著（P0.01） 。经过红外光谱检测，其结石成分主要为胆色素，提示成功建立了胆色素结石模型。经中药升清胶囊预防性干预后，豚鼠胆色素结石成石率下降至 31%，与模型组比较有显著差异（P0.05） ，证明该中药具有明显的防石作用。3.2 升清胶囊在分子水平对胆石病的影响 胆结石的形成中，胆固醇和胆红素这两大类物质扮演了重要的角色，致石性胆汁中主要成分变化也即发生在这两大类物质中，而在分子水平上对这类物质的调控可能是阻止胆石病发生发展的关键。3.2.1 升清胶囊对胆石病相关基因 BUGT 表达的影响 据流行病学资料3,4 ，有胆石病家族史者及 Gilb
18、ert 综合征（先天性家族性高胆红素血症）患者胆石发病率较高，提示胆石的形成可能存在基因水平异常。机体通过胆红素的葡萄糖醛酸化使脂溶性的游离胆红素（unconjugated bilirubin, UCB）变成水溶性的结合胆红素（conjugated bilirubin, CB） ，随之排出体外，在这一过程中肝脏 BUGT起着关键作用5 。人体每天产生一定量的 UCB，UCB 的酯化是维持胆红素溶解于各种体液中并顺利完成生理功能的重要因素。有关胆石的研究指出：胆色素结石患者的胆汁中，胆红素的总量并无显著升高；而是游离型胆红素占总胆红素的比值明显高于正常（2%） ，而且胆汁总体溶解度下降，这充分提
19、示游离型胆红素对成石的重要性6 。人体通过胆红素的葡萄糖醛酸化使脂溶性的 UCB 变成水溶性的 CB，随之排出体外，BUGT 在这一过程中起关键作用。本实验发现，正常组动物 BUGT 基因 mRNA 表达量显著高于模型组（P0.05） ，提示致石饮食中的某些因素干扰了 BUGT 基因 mRNA 表达，可能导致 BUGT 的活性降低，影响胆红素的葡萄糖醛酸化，促使结石的形成。而中药组 BUGT 基因 mRNA 相对表达量高于模型组，两组比较差异显著（P0.05） 。虽然 BUGT 基因 mRNA 相对表达量在中药组与正常组之间也有差异（P0.05） ，但差异程度明显小于模型组。表明治疗组对致石饮
20、食作用下豚鼠的肝脏 BUGT 基因 mRNA 表达有上调作用。升清胶囊这种对 BUGT 基因表达的上调作用，可能是其在分子层面干预结石形成的重要机制。3.2.2 升清胶囊对胆石病相关基因 CYP7A1 表达的影响 内源性胆固醇合成增加，胆酸合成减少，是造成胆汁胆固醇过饱和的常见原因。 羟 甲基戊二酰辅酶（hydroxymethylglutaryl coenzyme A, HMGCoA）还原酶及 CYP7A1 分别是胆固醇及胆酸合成的限速酶，肝脏在调节胆固醇体内平衡中起重要的作用79 。通常根据甾醇核修饰反应和侧链氧化剪切反应的先后将胆汁酸的生物合成途径分为经典途径和替代途径。不溶于水的胆固醇转
21、化成水溶性胆汁酸的过程，在体内约 40%是通过经典途径被代谢的10 。CYP7A1 是经典途径的起始酶，它的活性代表着机体清除胆固醇的能力。有人对肝内胆管结石患者肝脏 HMGCOA 还原酶及 CYP7A1 基因 mRNA 丰度及酶的活性检测发现，原发性胆管内胆固醇合成的向上调节及胆酸合成的向下调节，导致了胆汁胆固醇过饱和及含丰富胆固醇的色素结石的形成，胆石症患者的 CYP7A1 mRNA 水平低于一般人群11 。在本实验中，模型组与正常组相比，CYP7A1 mRNA 水平有明显差异(P0.05)，提示模型组动物在致石饮食作用下，CYP7A1 基因表达下降，胆固醇转变成胆汁酸受阻，胆汁中胆固醇增
22、加，促使结石形成。而中药组 CYP7A1 基因 mRNA 相对表达量虽稍低于正常组，但明显高于模型组(P0.05)。表明治疗组对低蛋白致石饮食作用下豚鼠的肝脏 CYP7A1基因 mRNA 的表达有上调作用。升清胶囊可能通过上调 CYP7A1 基因表达，在一定程度上增加胆汁酸的合成，降低胆汁胆固醇浓度，预防致石胆汁的形成，达到防止结石形成的目的。参考文献1 宋华荣, 朱培庭, 张静, 等. 胆石净溶石作用的实验研究J. 上海中医药大学学报, 2002, 16(2): 4244.2 徐长生, 朱培庭 , 曹中平, 等. 胆色素结石的动物模型及药物防治的实验研究J. 中华消化杂志, 1982, 2(
23、1): 3436.3 Leoci C, Chiloiro M, Guerra V, et al. Genetic epidemiology of choleli thiasis: A casecontrol study of a populationJ. Minerua Gastroenterol Dietol, 1991, 37(1): 3539.4 Pannwitz H, Nurnberg D, Berndt H. Epidemiology of gallbladder calculi in young femalesJ. Leber Magen Darm, 1990, 20(4): 18
24、9194.5 杨文奇, 祝学光 , 张红军, 等. 肝脏胆红素葡萄糖醛酸化障碍对胆石形成的作用J. 中华消化杂志, 1999, 19(1): 6768.6 吴阶平, 裘法祖主编. 黄家驷外科学 M. 第 6 版. 北京: 人民卫生出版社, 2002. 1282.7 Shoda J, He BF, Tanaka N, et al. Primary dual defect of cholesterol and bile acid metabolism in liver of patients with intrahepatic calculiJ. Gastroenterology, 1995, 1
25、08(5): 15341546.8Javitt NB. Choleserol homeostasis: role of the LDL receptorJ. FASEB J, 1995, 9(3): 13781381.9 Brown MS, Goldstein JL. A receptormediated pathway for cholesterol homeostasisJ. Science,1986, 232(4746): 3437.10 Vlahcevic ZR, Heuman DM, Hylemon PB. Regulation of bile acid synthesisJ. Hepatology, 1991, 13(3): 590600.11 Rudling M. Hepatic mRNA levels for the LDL receptor and HMGCOA reductase show coordinate regulation in vivoJ. J Lipid Res, 1992, 33(4): 493501.
