1、炭疽芽孢 DNA 适配子结构与长度对亲和力的影响作者：甄蓓 宋亚军 郭兆彪 王 津 俞守义 杨瑞馥 【关键词】 芽孢杆菌 关键词: 芽孢杆菌，炭疽;配体;亲和力 摘 要:目的 研究炭疽芽孢适配子结构与长度变化对其与芽孢之间亲和力的影响. 方法 人工合成 f77-1适配子序列，并构建在其 7条突变体序列，将这些寡核苷酸序列分别与炭疽芽孢结合，利用 TMB显色系统判断读取吸光度 A值，确定各序列与芽孢间亲和力大小;同时通过核酸序列分析软件包模拟各序列的二级结构，推断适配子的结构与亲和力之间的关系. 结果 适配子 f77-1与突变体中的 f77-3与芽孢亲和力较好，约是突变体中 f77-4亲和力的
2、11倍，二级结构显示:f77-1，f77-3 都具有茎环或发卡结构，且 3端都有连续 3个 G. 结论 适配子 5端的茎环结构和发卡结构是这些寡核苷酸序列与芽孢结合的结构基础，3端的连续 3个 G可能对提高亲和力起着重要的作用. Keywords:Bacillus anthracis;ligands;affinity Abstract:AIM To determine the effects of aptamers length and structure on its binding affinity to spores of Bacillus an-thracis vaccine stra
3、in A.16R.METHODS An oligonu-cleotide aptamer f77-1and its seven mutants were synthe-sized.Binding of oligonucleotides to spores was visualized by biotin-streptavidin-horseradish peroxides system.All theo-retical secondary structures were caculated using the Fold subroutine of the DNASIS v2.5software
4、 package based on a free energy minimization algorithm.RESULTS Affinities of the aptamer f77-1and mutant f77-3were11times higher than that of mutant f77-4.And the theoretical secondary structures calculated showed that they had stem-loop or hair-pin at5end of the aptamer and mutant and GGG sequences
5、 at3end of the structures.CONCLUSION Stem-loop and hairpin at5end of the aptamer work as main motif in the in-teraction between oligonucleotides and spores.Meanwhile，GGG sequences at3end of the aptamer play an important role in determining its binding capacity. 0 引言 核酸技术及其相关学科的发展对核酸的功能有了新认识1-3 .研究表明
6、，核酸分子依赖于其高级结构形成的构象，与靶物质特异性结合.这种核酸分子称为适配子（aptamer） ，其原意源于拉丁语“aptus” （适合） ，它是从一个随机单链寡核苷酸库中经体外 SELEX（systematic evolution of ligands by expo-nential enrichment）技术筛选出来的.适配子与靶物质的结合是结构依赖性，而不是序列依赖性的，适配子这种与靶物质结合的特性同抗体与抗原结合的特性非常相似4 .我们以炭疽芽孢为靶标，用 SELEX技术进行了 18轮筛选的适配子之一的序列 f77-1和其 7条突变体，分别进行亲和力检测和计算机二级结构的模拟分析，
7、探讨适配子的结构与长度对亲和力影响的规律. 1 材料和方法 1.1 材料 适配子 f77-1及其突变体设计与合成:f77-1 是以炭疽杆菌芽孢为靶标、从随机区域为 35个核苷酸 DNA寡核苷酸库中用 SELEX技术经 18轮筛选出的某一个适配子序列，其长度为 32个核苷酸5 ;又分别在其 3端和 5端进行了不同核苷酸数的缺失，合成长度不同的 7条寡核苷酸序列，本文中所合成的 f77-1及其突变体的 5端均有生物素标记（Tab1）.链霉亲和素、辣根过氧化物酶购于 Promega公司.按照文献6制备链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物.炭疽芽孢杆菌芽孢制备参照文献7 ，将配制的 11013 L-1 芽
8、孢贮液贮存于 4冰箱内备用.结合缓冲液和洗涤缓冲液参照文献8配制. 表 1 适配子 f77-1及其突变体序列略 1.2 方法 在 400L2结合缓冲液中，按 DNA:芽孢的比例组成结合反应体系，37振荡 30min，离心，弃上清;加入 1900 的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 100L 反应 10min，离心，弃上清;用 400L1洗涤缓冲液悬浮芽孢后离心，弃上清，重复洗涤 5次，洗去未与芽孢上DNA-生物素结合的酶-链霉亲和素结合物，以 TMB（四甲基联苯胺）显色，终止后用 Microreader4酶联阅读仪（Hyperion，USA）于 450nm测定吸光度 A值 8 .DNA二级结构分析
9、利用 DNASIS v2.5软件包，通过计算自由能最低能量值，预测寡核苷酸的二级结构. 2 结果 适配子 f77-1及其突变体与芽孢结合的吸 A值，f77-1，f77-3 的 A值相对高一些，且与其他几个突变体有明显差异（Tab2） ，说明这两个寡核苷酸对芽孢的亲和力比较高;f77-1 是经过 18轮 SELEX筛选出来的产物，而 f77-3是在 f77-1的 5端缺失 5个核苷酸得到的突变体，且在 3端有 3个连续的 G;其他寡核苷酸间的 A值无明显差异，且都较低，说明这些片段与芽孢的亲和力低甚至没有.模拟的二级结构表明，f77-1 和 f77-2的 5端都有两个连续的茎环结构，只是 3端的
10、长度不一样;f77-4，f77-5 在序列中间都形成了发卡结构;f77-3，f77-6，f77-7，f77-8全都为 5端形成的发卡结构，而 3端的长度不同，f77-6，f77-7，f77-7 的 3端都缺失了 3个连续的 G. 表 2 f77及其突变体结构特征和它们与芽孢亲和的吸光度 略 3 讨论 适配子可以与靶物质结合形成亲和力较强的复合物，这种亲和力有时甚至强于天然配基，只有在特殊洗脱溶液中才能将适配子从靶物质上洗脱下来.适配子复杂的空间构象，以及它们与靶物质相互特异结合的性质对我们研究分子识别过程具有非常重要的意义4 .多轮筛选后得到的适配子可以是一个家族，也可以是多个家族，这些家族是
11、一群寡核苷酸，它们具有基本一致的空间构象，且亲和力相近8-10 . 图 1 略 我们在前期完成的研究中，选出亲和力较高的序列 f77-111 ，分别在 f77-1的 3端和 5端缺失特定数目的核苷酸，形成 7个突变体，并考察了它们与芽孢间的亲和力.从结合实验的 A值看，f77-4，f77-5 虽然有茎环结构，但不是在 5端形成的，可能这种结构不太稳定，故 A值较低;f77-2，f77-6，f77-7，f77-8 在 5端形成了茎环结构或发卡结构，但在它们的 3端无 3个连续的 GGG，所以，它们的 A值也并不高.因此，5端的茎环结构和发卡结构可能是适配子与芽孢相结合的结构基础，一旦这个保守区域
12、的结构破坏了，则核酸与芽孢结合力降低或无结合力.实验提示，3端的 3个连续的 GGG是本实验中适配子与芽孢高亲和力结合的关键，说明远程分子间的相互作用或远程的三级结构可能对适配子与芽孢之间亲和力大小有一定的影响4，12 .芽孢是一个多表位的靶物质，用随机的寡核苷酸库来筛选与炭疽芽孢结合的核酸序列，它们都与芽孢有不同程度的亲和力，按其一级保守序列可以分为若干个家族.这些现象表明，对某种特定生物功能，有多种分子可以承担;即使目前自然界存在完成该功能的某特定分子，也可以人为筛选出与其在功能上完全相同而在一级结构并不相同的分子.本实验只是将可与炭疽芽孢特异结合的单个适配子序列作为研究对象，进行了其构象
13、与亲和力间关系的探讨，寻找出了它们之间可能存在的规律，为今后适配子三维空间结构的研究，并进一步提高适配子的亲和力奠定了基础. 参考文献: 1Feng YQ，Yan XJ，Su CZ，Zhang J，Jiang H.Cloning and se-quence analysis of L1major capsid protein gene of human papil-lomavirus type11J.Di-si Junyi DaxueXuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22（6）:493-496. 2Liu JY，Guo Y，Zheng ZX，Zeng GY
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