1、细胞毒药物下调细胞外调节蛋白激酶与抑制肝癌 SMF7721 细胞增殖【关键词】 肝肿瘤 关键词: 肝肿瘤;蛋白激酶类;细胞周期;细胞分裂 摘 要:目的 研究三种细胞毒药物（三尖杉酯碱，长春新碱，足叶已甙）抑制肝癌 SMF7721 细胞增殖、阻滞细胞周期过程中，细胞外调节蛋白激酶（extracelluar regulated protein kinases ERK1/2）磷酸化蛋白表达水平的变化.探讨细胞毒药物杀伤肝癌 SMF7721 的作用机制. 方法 采用 MTT 法测定增殖抑制率，应用流式细胞术检测细胞周期，应用Western blot 方法观察 ERK1/2 磷酸化蛋白表达水平的变化.
2、结果 三种细胞毒药物（三尖杉酯碱，长春新碱，足叶已甙）均能不同程度的抑制SMF7721 细胞增殖，抑制率分别为（288）%， （2516）%和（2411）%;三尖杉酯碱可使 SMF7721 细胞周期阻滞于 G1 期，长春新碱可使其阻抑于S 期和 G2/M 期，Vp16 则使之受抑于 G2/M 期.受这三种细胞毒药物作用后，肝癌 SMF7721 细胞内处于活化状态的磷酸化 ERK1/2 蛋白表达水平下降.ERK1 分别为对照组的 43%，32%，72%，ERK2 分别为对照组的29%，20%，61%. 结论 ERK 通路可能是细胞毒药物杀伤肝癌细胞SMF7721 的作用机制之一. Keyword
3、s:liver neoplasms;protein kinases;cell cycle;cell division Abstract:AIM To study the change of phosphorylated（ac-tivated）ERK1and ERK2protein expression in the course of inhibiting hepatocarcinomatous cell proliferation and arresting cell cycle progression by three kinds of cytotoxic drugs，Har-ringto
4、nine（HRT） ，Vincristine（VCR）and Etoposide（Vp16） ，and to discuss the killing mechanisms of cytotoxic drugs to hepato-carcinomatous cell，SMF7721.METHODS Proliferation inhibition rate was detected by MTT method.The cell cycle was analyzed by flow cytometry.The change of the phosphorylated ERK1/2protein
5、expression was ob-served by Western blot method.RESULTS Three kinds of cytotoxic drugs（HRT，VCR and Vp16）inhibited hepatocar-cinomatous cell proliferation to some extent.The inhibition rate was（288）%， （2516）%and（2411）%respective-ly.The cell cycle was blocked in G1phase with HRT.The cell cycle was blo
6、cked in S phase and G2/M phase with VCR.And the cell cycle was blocked in G2/M phase with Vp16.In experimental groups，the contents of phosphorylated ERK1and ERK2protein which was active in hepatocarcinomatous cell SMF7721obviously declined.With the effects of three cytotoxic drugs，the content of ERK
7、1was43%，32%and72%respectively;the content of ERK2was29%，20%and61%respectively.CONCLUSION It might be through ERK signal transduction pathway for cytotoxic drugs to inhibit hepatocarcinomatous cell SMF7721proliferation and arrest cell cycle progression. 0 引言 细胞外调节蛋白激酶（extracelluar regulated protein k
8、inases，ERK）通路与细胞恶性表型转变有着密切关系，对 ERK 通路的阻断将有助于抑制恶性肿瘤细胞的生长.我们选用了几种常用细胞毒药物，探讨对 ERK 通路的调控是否为细胞毒药物杀伤肝癌细胞的作用机制之一. 1 材料和方法 1.1 材料 SMF7721 细胞引自武汉大学典型物培养中心.采用含100mLL-1 胎牛血清、110-5 UL-1 青霉素、110-5 gL-1 链霉素的 RRMI1640 培养基，在 37，50mLL-1 ，CO2 饱和湿度培养箱中培养，每 23d 换液传代，实验选用对数生长期细胞.三尖杉酯碱（harringtonine，HRT）:北京协和药厂产品，批号97119
9、1;足叶已甙（etoposide，Vp16）:连云港恒瑞制药有限公司，批号990504;长春新碱（vincristine，VCR）:上海华联制药有限公司，批号991001;四甲基偶氮唑盐（MTT） 、二甲基亚砜（DM-SO） 、碘化丙啶（PI） ，RNaseA 均为 Sigma 产品.胎牛血清（FCS）及 RPMI1640 培养基由 Gibco 公司提供;抗磷酸化 ERK1/2 多克隆抗体购于 Santa Cruz. 1.2 方法 实验分 4 组:未加药物组;HRT 组;VCR 组;Vp16 组.细胞终密度为 1109 L-1 ，实验体系总体积为 180L.置 37，50mLL-1 CO2 ，
10、饱和湿度培养箱中培养 24h 后，离心弃上清，加入（5gL-1 ）MTT20L 后继续培养 4h，再加 DMSO200L 终止反应，用 Bio-Rad M450 酶标仪（波长 540nm）测定吸光度（A 值）.药物终浓度分别为:HRT510-4 gL-1 ，VCR210-4 gL-1 ，Vp16410-3 gL-1 .按下式计算药物对细胞的抑制率1 :细胞抑制率（%）=（1-实验孔 A 值对照孔 A 值）100%.分别用上述浓度的 HRT、VCR 和 Vp16 处理 SMF7721 细胞株 24h，取 110 6 个细胞，PBS 洗 3 次，700mLL-1 乙醇固定，RNase A（510-
11、5 gL-1 ）消化 30min 后，加入 PI（0.5gL-1 ）30L，避光染色 30min，流式细胞仪分析细胞 DNA 含量分布，资料均经ModFitLTR 软件收集、储存和分析2 .取上述药物作用后细胞 1107 个，加入预冷的细胞裂解液 200L，冰上裂解 20min，离心，取上清，751 分光光度仪测蛋白含量，每份样品取 30g 蛋白进行100mLL-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移至硝酸纤维素膜上.该膜经 50mLL-1 脱脂奶粉封闭后，与抗 ERK1/2 磷酸化抗体孵育过夜，用碱性磷酸酶标记二抗和 BCIP/NBT 底物显色.图像经 Uvp grab-it Imagel
12、软件采集，Gelworks1D Ad-vanced v4.01 软件处理分析3 . 2 结果 2.1 SMF7721 细胞增殖 HRT（510-3 gL-1 ） ，VCR（110-3 gL-1 ）和 Vp16（410-3 gL-1 ）作用24h 均能不同程度的抑制 SMF7721 细胞增殖，抑制率分别为:（288）%， （2516）%， （240.11）%. 2.2 细胞周期阻滞 细胞毒药物作用 24h 后，细胞周期受到阻滞，其中，HRT 阻抑细胞于 G1 期，VCR 阻抑细胞于 S 期和 G2/M 期，Vp16 则使之受抑于 G2/M 期（Tab1）. 表 1 细胞毒药物对肝癌细胞 SMF7
13、721 细胞周期的影响 略 2.3 细胞毒药物抑制 ERK1/2 磷酸化 HRT，VCR 和 Vp16 作用 24h 后，SMF7721 细胞内 ERK1/2 磷酸化蛋白含量明显下降;利用 Gelworks1D Advanced v4.01 软件对各试验组图像灰度值分析，ERK1 分别为对照组的43%，32%，72%，ERK2 分别为对照组的 29%，20%，61%，这表明磷酸化ERK1/2 蛋白表达减少（Fig1）.而磷酸化状态的 ERK1/2 蛋白表达水平可间接反映 ERK1/2 功能活性的高低. 图 1 略 3 讨论 ERK 是 Ras/Raf/MEK/ERK1/2 信号传递通路上与细胞
14、核最为靠近的成员，属于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族，正常及恶性细胞受到某些外界刺激后，可通过磷酸化激活 ERK1/2，使之由胞质转位到核内，进而介导 Elk-1、ATF、NF-B，Ap-1，c-fos，c-jun 的转录活化，参与细胞分化和凋亡等多种生物学反应4，5 .在急性白血病和肾细胞癌等恶性疾病中，均发现 ERK的构建性活化，提示 ERK 通路的激活可能参与了正常细胞的恶性转变过程6 .Boucher 等7 研究证实活化 ERK 通路可避免胰腺癌细胞凋亡，并能促进细胞周期的进展.Kang 等8 研究证实白血病细胞 K
15、562抗凋亡特性与 ERK 基础活性较高有关，ERK 活性受抑后，可使 K562 发生凋亡.可见 ERK 通路在恶性细胞的发生发展中发挥着重要作用，下调 ERK活性将有助于抑制癌细胞的生长发育.因此，细胞毒药物杀伤肿瘤细胞的机制之一可能就在于对 ERK 通路的抑制. 为证实此推断，我们在实验中选用了肝癌细胞系 SMF7721 作为靶细胞，利用 3 种作用特性各异的细胞毒药物 HRT，VCR 和 Vp16 作为诱导剂，研究了 ERK1/2 在细胞毒药物杀伤肝癌细胞中的作用.其中，HRT 为周期非特异性药物;VCR 为 M 期周期特异性药物;Vp16 为 S 期与 G2 期周期特异性药物.结果表明
16、细胞毒药物 HRT，VCR 和 Vp16 能够下调 SMF7721 细胞磷酸化状态的 ERK1/2 蛋白的表达水平;也可使细胞增殖受到抑制，阻滞细胞周期进展.基于此，我们认为以上 3 种细胞毒药物杀伤肝癌细胞 SMF7721的分子机制可能是通过抑制 Ras/Raf/MEK/ERK1/2 信号传递通路，降低ERK 活性，减少 ERK1/2 靶基因的转录活化，抑制细胞增殖，阻滞细胞周期进展.总之，在肝癌治疗过程中，ERK/MAPK 通路可能是细胞毒药物重要的作用靶点. 参考文献: 1Zhao JB，Cui Q，Zhang X，Wang WL，Jiang YP.Experiment study on
17、 anticancer action of cinobufagin in vitro J.Di-si Jun- yi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22（16）:1504-1507. 2Lei JJ，Hai CX，Cao YX.Effect of low concentration hydrogen peroxide on proliferation of human leukemic cells in vitro J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22（12）:
18、1089-1091. 3Ji SP，Yao LB，Han YH，Liu XP，Su CZ.Recombinant GRF PH domain down-regulates activity of protein kinase C J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22（1）:5-7. 4Tresini M，Lorenzini A，Frisoni L，Allen RG，Cristofalo VJ.Lack of Elk-1phosphorylation and dysregulation of the extracel
19、-lular regulated kinase signaling pathway in senescent human fi-broblast J.Exp Cell Res，2001;269（2）:287-300. 5Goetze S，Kintscher U，Kaneshiro K，Meehan WP，Collins A，Fleck E，Hsueh WA，Law RE.TNF alpha induces expression of transcription factors c-fos，Egr-1，and Ets-1in vascular le-sions through extracell
20、ular signal-regulated kinases1/2J.Atherosclerosis，2001;159（1）:93-101. 6Kim SC，Hahn JS，Min YH，Yoo NC，Ko YW，Lee WJ.Con-stitutive activation of extracelluar signal-regulated kinase in hu-man acute leukemias:Combined role of activation of MEK，hy-perexpression of extracelluar singal-regulated kinase，and
21、downregulation of a phosphatase PAC1J.Blood，1999;93（11）:3893-3899. 7Boucher MJ，Morisset J，Vachon PH，Reed JC，Laine J，Rivard N.MEK/ERK signaling pathway regulates the expression of Bcl-2，Bcl-X（L） ，and Mcl-1and promotes survival of human pancreatic cancer cells J.J Cell Biochem，2000;79（3）:355-369. 8Kang CD，Yoo SD，Hwang BW，Kim KW，Kim DW，Kim CM，Kim SH，Chung BS.The inhibition of ERK/MAPK not the ac-tivation of JAK/SAPK is primarily required to induce apoptosis in chronic myelodenous leukemic K562cell J.Leuk Res，2000;24（6）:527-534.
