1、兴安升麻总苷抗肿瘤药效研究作者：曹丽,杨卫彬,潘瑞乐,李玲玲,金文,孙虹,孙晓波【摘要】 目的 观察升麻总苷对小鼠移植性肿瘤和人肿瘤细胞裸鼠移植瘤的体内抗肿瘤作用,以及体外对人肿瘤细胞株的抑瘤活性,并对其抑瘤机制进行初步探讨。方法 MTT 法检测体外升麻总苷对人肿瘤细胞的增殖抑制作用；体内实验观察其对小鼠 S180 和裸鼠体内移植人肺腺癌 A549的抑制作用；同时采用流式细胞仪和肿瘤病理切片对接种的 A549 肿瘤细胞凋亡进行观察。结果 升麻总苷对 A549、HepG2、HL60、Eca-109、MDA-MB231 肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为 20.3、27.1、21.2、23.
2、4和 32.7 g/mL。小鼠口服升麻总苷 100 mg/kg 和 200 mg/kg 可明显抑制S180 移植瘤(抑瘤率分别为 42.8%和 54.6%)和裸鼠移植人肺腺癌 A549 的生长(T/C 值分别为 58.1%和 52.2%),肿瘤组织病理切片和流式细胞仪对A549 肿瘤细胞凋亡的检测显示,升麻提取物可诱导体内肿瘤细胞凋亡。结论 升麻体内体外均具有抗肿瘤活性,其体内抑制肿瘤生长可能与诱导细胞凋亡相关。 【关键词】 升麻总苷；小鼠 S180 肉瘤；裸鼠；人肺腺癌 A549；凋亡Key words：total glycoside of Cimicifuga dahurica；Sarco
3、ma 180 tumor cells；nude mice；human pulmonary carcinoma A549；apoptosis目前,肿瘤的化学治疗已经取得很大进展,许多癌症通过化学治疗得到缓解甚至治愈。但是,目前化疗药物仍存在毒副反应大以及肿瘤细胞对药物产生耐药等问题,因此,迫切需要开发新的高效、低毒的抗肿瘤药物。升麻具有发表透疹、清热解毒、升举阳气等功能,用于风热头痛、齿痛、口疮、咽喉肿痛、麻疹不透、阳毒发斑、脱肛、子宫脱垂等症1。2005 年版中华人民共和国药典(一部)收载的升麻为毛茛科植物升麻(Cimicifuga foetida L.)、兴安升麻(C.dahurica Ma
4、xim.)和大三叶升麻(Cheracleifolia Kom.)的根茎。近年来对升麻药理活性的研究表明,升麻三萜类化合物体外具有明显的抗肿瘤细胞增殖作用2-4,口服升麻提取物可明显抑制小鼠肝癌 H22 的生长,升麻抗肿瘤活性与诱导肿瘤细胞凋亡相关5。为了进一步明确升麻的抗肿瘤活性,笔者采用兴安升麻总苷提取物对小鼠移植瘤及裸鼠体内移植人肿瘤细胞的影响进行观察,为升麻的应用奠定基础。1 材料与方法1.1 药物及试剂兴安升麻总苷(TGCD)的制备：原材料于 2004 年 9 月采自内蒙古自治区喀喇沁旗茅荆坝,经鉴定为兴安升麻。将升麻地下部分粉碎过筛后,以 10 倍量的 80%乙醇加热回流提取 3 次
5、,每次 1 h。提取完毕,过滤,滤液减压浓缩至波密度为 1.12 时加入吸附剂硅藻土进行柱层析。先以工业己烷洗去油脂,然后用乙酸乙酯洗脱,得到的乙酸乙酯部分经减压浓缩得总苷,收率为 5%6%,以 27-脱氧升麻亭为对照品,比色法测定升麻总苷含量达 60%。5-氟尿嘧啶(5-FU)为天津金耀氨基酸有限公司产品,批号0703021；环磷酰胺(CPX)为山西普德药业有限公司产品,批号 20050604；紫杉醇为北京四环医药科技股份有限公司产品,批号 0612181。培养基RPMI-1640、DMEM、MTT 为 Gibco 公司产品,胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。1.2 动物ICR 小
6、鼠,雄性,1822 g；BALB/c 品系裸鼠,雄性,1618 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号 SCXK (京)2007-0001。1.3 细胞株人肺腺癌细胞 A549 购自中国医学科学院肿瘤研究所,人食道癌细胞 Eca-109 购自中国科学院上海细胞中心,小鼠肉瘤 S180 购自北京大学医学部动物中心,人白血病细胞 HL-60、人肝癌细胞 HepG2、人乳腺癌细胞 MDA-MB231 均由常规液氮保存。1.4 升麻总苷体外抑瘤活性的测定参照文献6方法,收集生长良好的肿瘤细胞,用含 10%小牛血清的RPMI- 1640 或 DMEM 培养基配成 1104/mL 细胞悬液,接
7、种于 96 孔板内,每孔 100 L,37 、5%CO2 孵箱培养 24 h 后,加入待测 TGCD 药液(药物终浓度 10、20、40、80、100、200 g/mL),每浓度设 3 个平行孔,实验设空白对照和阳性对照药孔。阳性对照药为 5-FU(药物终浓度0.1、1、10 g/mL)。培养 4 d 后弃上清, 每孔加入 MTT 液 10 L(5 mg/mL,RPMI-1640 培养基配制)后继续培养 4 h,每孔加入 100 L 酸化异丙醇细胞裂解液,过夜培养,用 Bio-Tek MQX200 型酶标仪在检测波长 540 nm、参考波长 450 nm 下测吸光度(A)值,计算每个浓度抑制率
8、和,用SPSS10.0 统计软件计算出 IC50 值。1.5 升麻总苷体内对小鼠 S180 移植性肿瘤的药效观察取小鼠传代后第 710 日的肿瘤组织,研磨成细胞悬液,用无菌生理盐水稀释,细胞浓度为 1107/mL,于小鼠右前腋皮下接种,0.2 mL/只,接种全过程在无菌操作下完成。第 2 日分组给药,5 组分别为模型对照组、阳性药对照组(腹腔注射 CPX 30 mg/kg)及 TGCD 低、中、高剂量组(50、100、200 mg/kg),阳性药对照组,每组 10 只。每天给药 1 次,共 10 d。末次给药后 24 h 处死动物,称体重后完整剥离瘤块并称重,计算抑瘤率。1.6 升麻总苷对裸鼠
9、体内移植人肿瘤细胞的抑瘤作用在超净台内无菌操作下取出在裸鼠体内生长良好的肿瘤结节,剪成1 mm3 大小的小瘤块,采取套管针小块接种法,将瘤块埋植于 BALB/c 系裸鼠右腋窝皮下。待肿瘤长出并可触及时,将动物随机分为 5 组,每组 6 只,分别为模型对照组、阳性药对照组及 TGCD 低、中、高剂量组(50、100、200 mg/kg)。实验组每日灌胃 TGCD 悬液 1 次,连续给药 18 d。阳性药对照组腹腔注射紫杉醇 15 mg/kg,每周 2 次,给药期限同实验组。裸鼠饲养在室温 2022 ,相对湿度 40%60%,并具屏蔽系统辅以洁净层流柜的环境内。于实验开始后每周 2 次用卡尺测量肿
10、瘤体积,绘出肿瘤生长曲线。末次给药结束后 24 h,处死动物,称体重后完整剖取瘤块,分别以下式计算肿瘤体积和抑制肿瘤的 T/C(%)值：肿瘤体积(V)肿瘤长径(肿瘤短径)2/2T/C给药组平均肿瘤体积(T)/对照组平均肿瘤体积(C)100%抑瘤率(%)1给药组平均瘤重(T)/对照组平均瘤重(C)100%1.7 升麻总苷对裸鼠移植瘤 A549 细胞凋亡的影响称重移植瘤后,切取移植瘤组织约 2 mm2 mm2 mm,研磨,离心,制成单细胞悬液,加入结合 buffer 调整细胞数为 5105/mL,取 195 L细胞重悬液,加 5 L AnnexinV/FITC,室温下混合,孵育 10 min。加入
11、200 L 结合 buffer,清洗细胞,于 4 1 000 r/min 离心 10 min。弃上清,加入 190 L 结合 buffer,重悬细胞,加入 10 L 浓度为 20 mg/L 的PI,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。其余移植瘤组织用 4%中性甲醛固定,脱水,常规石蜡包埋,5 m 切片,HE 染色,显微镜下观察细胞凋亡情况。1.8 统计学方法定量数据以 xsxs 表示,体内药效实验结果用 Office Excel 软件进行 t 检验,求 P 值,P0.05 为差异有统计学意义。体外抑制肿瘤细胞的 IC50 值用 SPSS10.0 统计软件计算。2 结果2.1 升麻总苷对人肿瘤细胞增殖的
12、抑制作用TGCD 对 5 种肿瘤细胞均有明显的抑制作用,对 A549 和 HL-60 的抑制效果最好,IC50 值分别为 20.3、21.2 g/mL。结果见表 1。表 1 升麻总苷对人癌细胞株生长的抑制作用(略)2.2 升麻总苷体内对裸鼠 A549 移植瘤的抑制作用TGCD 100、200 mg/kg 对 A549 细胞裸鼠移植瘤的抑瘤率与模型对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05),T/C 值分别为 58.1%和 52.2%,均低于 60%,表明其抗肿瘤是有效的,阳性药紫杉醇 T/C 值为 47.9%,50 mg/kg 的 TGCD 对 A549 抑瘤作用不明显。病理结果显示,模型对照
13、组肿瘤细胞核大、核质比例大,细胞形态完整。紫杉醇组大部分肿瘤细胞核深染,细胞皱缩体积变小,显示明显的凋亡形态。TGCD 200 mg/kg 组肿瘤组织出现大面积的细胞核深染,细胞皱缩体积变小等类似紫杉醇组肿瘤细胞样的凋亡形态,TGCD 100 mg/kg 组同样出现一些明显的凋亡细胞,但数量少于紫杉醇组和 TGCD 200 mg/kg 组。2.3 升麻总苷体内对小鼠 S180 移植性肿瘤的抑制作用实验过程中,模型组有 2 只动物死亡、TGCD 中、低剂量组各有 1 只动物死亡。TGCD 对 S180 小鼠瘤株显示出较高的抑瘤率,中、高剂量TGCD(100 mg/kg,200 mg/kg)对 S
14、180 抑瘤率分别为 42.8%和 54.6%。结果见表 2。表 2 升麻总苷对小鼠 S180 移植性肿瘤的抑制作用(略)注：与模型对照组比较,*P0.01,*P0.001(下同)2.4 Annexin V/PI 流式细胞仪测定升麻总苷体内对裸鼠 A549 移植瘤细胞的促凋亡作用100 mg/kg 和 200 mg/kg 的 TGCD 对裸鼠 A549 移植瘤细胞具有明显的促凋亡作用,凋亡细胞百分率分别为 15.69%和 25.55%。结果见表 3。表 3 TGCD 对 A549 肿瘤细胞抑瘤作用(略)3 讨论现代药理研究表明,升麻具有镇痛、镇静、抗炎等活性,对其三萜类皂苷成分的深入研究发现,
15、其可有效缓解更年期骨质疏松,并具有明显的抗肿瘤作用1-4。本研究结果表明,TGCD 体外可明显抑制 A549、HL-60 等多种肿瘤细胞的增殖,其 IC50 值均低于 35 g/mL；体内可明显抑制 S180 肉瘤及裸鼠移植人肺癌 A549 的生长,其 100、200 mg/kg 剂量对 S180 的抑制率分别为 42.8%、54.6%,与模型对照组相比差异有统计学意义；对移植人肺癌A549 裸鼠的 T/C 值分别达到 58.1%和 52.2%,高剂量组与阳性药紫杉醇抑制作用接近,不同剂量组之间呈现明显的量效关系。在抗肿瘤药物治疗过程中,细胞凋亡是一种重要机制,细胞凋亡的诱导与促凋亡基因激活及
16、抗凋亡基因抑制有关,促凋亡基因功能衰退及抗凋亡基因功能增强都会诱导细胞凋亡。田氏等3研究发现,升麻地上部分提取物可通过升高 Bax/Bcl-2 的比值,活化 caspase3 以及抑制多聚聚合酶(PARP)的表达而诱导肝癌细胞 HepG2 的凋亡。本研究通过对裸鼠肿瘤组织病理切片观察可见,TGCD 可导致肿瘤细胞出现凋亡形态,此改变与阳性药紫杉醇的作用相似；进一步采用 Annexin V/PI 流式细胞仪双标记法测得其对裸鼠接种人 A549 肿瘤细胞具有明显的诱导凋亡作用,提示兴安升麻总苷体内抑制肿瘤的活性与诱导肿瘤细胞凋亡相关。已知的抗肿瘤药物的毒性是临床很棘手的问题,因此,从天然植物中发现
17、新的高效低毒抗肿瘤药物是目前研究的热点。研究表明,升麻对正常肝细胞和肝癌细胞是有一定选择性的,并对肝癌耐药株也有明显抑制作用6,裸鼠移植人肺癌 A549 的生长实验表明,TGCD 组动物体重没有阳性药物下降明显。而以升麻皂苷为主要成分的中药新药希明婷片作为国家“十五”863 计划成果,临床用于妇女更年期疗效显著,没有明显的毒性反应,说明 TGCD 提取物的毒性较低,因此升麻有可能成为新的抗肿瘤中药。【参考文献】1 刘 勇,陈迪华,斯建勇,等.升麻属植物的化学、药理与临床研究J.国外医药植物药分册,2001,16(2)：5558.2 田 泽,斯建勇,王 婷,等.24-O-乙酰升麻醇-3-O-D-
18、木糖苷对HepG2 细胞的细胞毒性及其作用机制J.中国药学杂志,2007,42(7)：505508.3 田 泽,斯建勇,陈四保,等.23-O-乙酰升麻醇-3-O-D-木糖苷对 HepG2 细胞的细胞毒性及其作用机制J.中国中药杂志,2006,31(21)：18181821.4 田 泽,斯建勇,黄 锋,等.兴安升麻地上和地下部分总苷生物活性比较J.中药材,2005,28(5)：372374.5 Tian Z, Pan RL, Chang Q, et al. Cimicifuga foetida extract inhibits proliferation of hepatocellular cells via induction of cell cycle arrest and apoptosisJ. J Ethnopharm,2007,114：227233.6 刘朝阳,王德昌,付招娣,等.参芪金康胶囊抗肿瘤作用的实验研究J.癌症,2006,25(8)：983989.
