1、肿瘤光动力学疗法与免疫效应分子【摘要】 光动力学疗法（photodynamic therapy，PDT）是治疗肿瘤的有效手段，多种免疫效应分子在 PDT 介导的局部及全身反应中发挥重要作用。本文介绍了肿瘤 PDT 后主要免疫效应分子表达的改变和作用，以及相关肿瘤 PDT 增效的研究进展。 【关键词】 光动力学疗法；免疫效应分子；肿瘤 光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)以其微创、选择性作用、可反复实施等优点在恶性肿瘤及某些良性疾病的治疗中受到越来越多的关注，其抗肿瘤的作用机制主要包括光敏效应产生的单线态氧直接杀伤肿瘤细胞或诱导凋亡、损伤微血管及肿瘤间质、继发的抗肿瘤
2、免疫反应1 。本文对肿瘤 PDT 后主要免疫效应分子表达改变及发挥的作用、联合应用免疫效应分子的激活物或抑制剂对 PDT 的增效作用作一综述。 1 肿瘤 PDT 诱导的免疫效应分子变化及作用 1.1 细胞因子 1.1.1 白细胞介素（interleukin，IL） 研究表明肿瘤 PDT 可诱导多种 IL 表达改变，介导治疗后宿主的炎症及免疫反应。de Vree 等2发现荷横纹肌肉瘤大鼠经光敏素为光敏剂的 PDT 后，肿瘤生长延缓，伴有治疗后 2 h 血清 IL-1 水平明显升高，424 h 血液成熟中性粒细胞数量显著升高;应用粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimu
3、lating factor，G-CSF）抗体，仅部分减少 PDT 引起的中性粒细胞升高，但肿瘤生长延缓时间明显缩短；认为 IL-1 直接引起骨髓储存池中性粒细胞释放，并通过诱导 G-CSF 刺激了中性粒细胞生成，G-CSF 又可增强中性粒细胞活性，发挥抑瘤作用。Gollnick等3研究发现，小鼠 EMT6 肿瘤光敏素-PDT 后 124 h，肿瘤组织中IL-6 mRNA 含量升高，IL-6 蛋白表达也增加，治疗后 24 h 流式细胞分析示肿瘤组织中巨噬细胞百分比升高 23 倍，提示 PDT 可能通过上调 IL-6的表达，募集巨噬细胞至治疗部位，杀伤肿瘤细胞并介导特异性抗肿瘤免疫的建立；而 PD
4、T 后肿瘤组织中 IL-10 mRNA 含量降低，减少了对 Th1型细胞应答的抑制。研究还发现小鼠 EMT6 和 Colo26 肿瘤光敏素-PDT 后24 h，肿瘤引流淋巴结中表达 IL-12 的抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APCs）增加，分离这些 APCs 与 T 细胞共同培养，可刺激 T 细胞增殖并分泌 -干扰素，说明 PDT 可激活 APCs，通过分泌 IL-12 诱导 Th1 型反应，促进抗肿瘤细胞免疫4 。Yom 等5对胸膜间皮瘤手术切除的患者联合应用术中 Foscan（meso-tetrakis m-hydroxyphenyl chlorin，m
5、-THPC）-PDT 治疗，发现单纯胸膜或肺切除术及联合 PDT 后，血清 IL-1、IL-6、IL-8、IL-10 水平均有升高，而且 PDT 后 IL-6 升高明显，认为这些细胞因子介导了胸部手术联合 PDT 后的全身炎症反应。Lai 等6发现鼻咽癌患者 PDT 后，血清可溶性 IL-2受体明显降低，而 IL-2 水平及 NK 细胞活性明显升高，表明 PDT 可通过升高血清 IL-2 增强免疫效应。Nseyo 等7研究发现膀胱癌患者 PDT 后，尿液中可检测到 IL-1、IL-2 和 TNF-，提示三者可能在 PDT 后的局部免疫中发挥作用。 1.1.2 血管内皮细胞生长因子(vascul
6、ar endothelial growth factor，VEGF) Osiecka 等8研究发现荷 BFS1 纤维肉瘤小鼠 PDT 后，血清 VEGF水平降低，肿瘤明显缩小甚至完全消退，治疗组荷瘤鼠生存期延长，认为 PDT 可降低血清促血管生成因子水平，影响肿瘤组织新生血管形成，抑制肿瘤生长。然而许多研究显示亚治疗剂量 PDT 或 PDT 后有残存肿瘤细胞时，可诱导 VEGF 表达升高。Deininger 等9以竹红菌素作为光敏剂，应用 4 mW/cm2 功率密度的激光，照射人类 LN229 胶质瘤细胞系 15 min（能量密度 3.6 J/cm2） ，发现治疗后肿瘤细胞中出现大量包涵体，但
7、无明显死亡征象，免疫印迹分析示内皮他丁等抗血管生成因子及 VEGF 均被诱导分泌。Uehara 等10对小鼠 NR-S1 鳞状细胞癌进行能量密度约270 J/cm2（15 mJ/cm2/脉冲，照射 30 min，平均功率密度 150 mW/cm2）的 PDT 治疗，光斑覆盖整个肿瘤，但治疗后周边区域仍有许多残存肿瘤细胞；免疫组化示 PDT 后 06 h 肿瘤组织中 VEGF 表达明显升高，之后下降，24 h 与对照组无明显差异，PDT 后 24 h 肿瘤血管内皮细胞增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达明显降低，48 h 恢复至对照
8、水平；认为 PDT 可迅速引起肿瘤组织严重缺氧，诱导 VEGF 升高，残存肿瘤细胞再氧化又使 VEGF 表达下降，肿瘤氧供恢复后，血管内皮细胞在 VEGF 作用下发生再增殖。Togashi 等11研究发现，人类 NT-1 口腔鳞状细胞癌经能量密度 60 J/cm2 的 PDT治疗后，肿瘤组织中 VEGF 表达情况与 Uehara 等10的结果一致，但PDT 后 24、48、72 h，肿瘤细胞 PCNA 的表达较对照组无明显变化，表明实验条件下，PDT 对残存肿瘤细胞的增殖能力无明显影响。Solban 等12也发现能量密度为 50 J/cm2 的苯并卟啉衍生物-PDT 后 24 h，人类 LNC
9、aP 前列腺癌细胞系及常位移植瘤中 VEGF 明显升高，而 p38 MAPK抑制剂可抑制其升高，提示 p38 MAPK 通路的激活可能与 PDT 诱导的 VEGF升高有关。临床 PDT 治疗中，由于激光穿透深度有限及肿瘤组织中光敏剂分布不均等因素，也难以完全杀灭肿瘤细胞，因此除注意给予足够的激光剂量、适时复照外，还可联合抗血管生成药物抑制 VEGF，以达到最佳抗瘤效应。 1.1.3 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF） TNF 具有抗肿瘤、调节免疫应答、介导炎症反应等生物学活性。Evans 等13研究发现应用光敏素敏化小鼠腹膜巨噬细胞后，予功率密度为 0.3 mW
10、/cm2 的激光照射，可诱导 TNF- 分泌增多，照射 45 min 时（能量密度为 7290 mJ/cm2）TNF- 升高达峰值，而延长照射时间至 30 min，TNF- 分泌完全消失，认为 PDT 后巨噬细胞产生的 TNF 可能直接杀伤肿瘤细胞，或通过影响微血管间接发挥抗瘤效应。Coutier 等14也发现人类 U937 巨噬细胞经能量密度为 28 mJ/cm2 的 Foscan-PDT治疗后，吞噬活性显著激活，TNF- 生成明显增多，对小鼠 L929 成纤维细胞瘤细胞系的杀伤作用增强，但随光剂量增加 TNF- 产生逐渐减少，能量密度为 0.2 J/cm2 时降至基线水平。上述两项研究均显
11、示，亚致死光剂量 PDT 诱导巨噬细胞产生 TNF- 的反应更明显，这与临床 PDT 治疗中巨噬细胞可能受到的光辐照剂量近似。Cecic 等15应用抗体特异性阻断 TNF- 功能，抑制了 PDT 后 2 h 出现的中性粒细胞升高，提示 TNF- 参与 PDT 后早期中性粒细胞升高的诱导。 1.1.4 趋化因子（chemokine） Gollnick 等16 应用甲基嗜焦素烷基醚衍生物（2-1-hexyloxyethyl-2-devinyl pyropheophorbide-a，HPPH）为光敏剂，对小鼠 EMT6 肿瘤行 PDT，发现治疗后 424 h 肿瘤组织中巨噬细胞炎性蛋白-2（macr
12、ophage inflammatory protein 2，MIP-2）水平明显升高； 6 h 肿瘤局部血管内皮黏附分子 E-选择素表达显著增强，48 h 恢复至治疗前水平；472 h浸润的中性粒细胞增多，应用抗体抑制 MIP-2 或 E-选择素活性后，肿瘤区中性粒细胞的聚集明显减少。这表明 PDT 可诱导趋化因子及黏附分子表达升高，引起治疗部位大量炎症细胞浸润；而入侵的炎症细胞可清除残存肿瘤细胞，并促进特异性抗肿瘤免疫的发展。 1.1.5 PDT 后细胞因子变化的影响因素及肿瘤细胞和宿主细胞对细胞因子反应性的变化 肿瘤 PDT 后细胞因子的变化极其复杂，受多种因素影响，而且 PDT也可引起肿
13、瘤及宿主细胞对细胞因子的反应性发生变化，研究中应予以注意。Du 等17应用 CNE-2 和 HK1 两种不同类型人类鼻咽癌细胞系及移植瘤研究发现，低分化、高表达 IL-6 的 CNE-2 细胞 PDT 后，IL-6 mRNA 及蛋白水平明显升高，而高分化、低表达 IL-6 的 HK1 细胞治疗后，IL-6 的转录和表达无变化；表明细胞类型、组织分化程度和细胞因子的基础表达可能影响 PDT 后细胞因子的变化。STAT3 是一种信号转导蛋白及转录蛋白活化因子，研究发现 PDT 可诱导残存肿瘤细胞中未激活的 STAT3特异性共价交联，使其不能转位至细胞核与 DNA 结合，并衰减经细胞因子受体通路的信
14、号转导，导致 PDT 后至少 24 h 细胞对 IL-6 和抑瘤素 M无反应，辅助肿瘤细胞逃避这些调节因子的抑制作用18 。Wong 等19以光敏素和 -氨基乙酰丙酸作为光敏剂，分别对几个上皮癌细胞系、正常上皮细胞和正常基质细胞进行 PDT 治疗，发现不同靶点 PDT 后，正常细胞和恶性细胞均失去对 IL-6 和表皮生长因子的反应，恢复需4872 h，伴有细胞再增殖；认为 PDT 降低了正常细胞和肿瘤细胞对介导免疫反应及辅助组织修复细胞因子的反应性，改变了这些细胞的调节能力。 1.2 补体 补体是一组存在于血清、组织液和细胞膜表面具有酶活性的蛋白质,激活后可产生具有炎症介质作用的活性片段，并形
15、成膜攻击复合体（membrane attack complex，MAC） ，为 PDT 诱导炎症反应的启动和促进因素。小鼠 EMT6 肿瘤 PDT 后 30 min，免疫组化检测示肿瘤细胞和血管内皮细胞表面及胞质中大量 MAC 沉积，表明 PDT 激活了补体系统15 。Cecic 等20发现小鼠 Lewis 肺癌经光敏素 PDT 后，肿瘤局部及血清中C3 水平明显升高，治疗后 2472 h 补体活化的旁路途径激活，而阻断C3a 或 C5a 受体肿瘤治愈率明显降低。研究显示小鼠 FsaR 纤维肉瘤 PDT后 1 h，血液中性粒细胞明显增多，持续升高至 24 h 后下降，补体活性也于治疗后迅速升高
16、，6 h 升高 2 倍达峰值，24 h 降至治疗前水平；PDT后中性粒细胞增多的时间范围与补体激活的时间动力学一致，提示补体级联激活反应产生的 C3a 和 C5a 与 PDT 诱导的中性粒细胞增多有关21 。研究还发现荷 FsaR 纤维肉瘤小鼠 PDT 后，血液中性粒细胞、单核细胞及B 淋巴细胞 C3a 受体表达升高，未治疗的小鼠腹膜巨噬细胞和肥大细胞与PDT 治疗的 FsaR 细胞混合培养后，C3a 受体也有所升高，而且特异性阻断 C3a 受体，可明显抑制 PDT 诱导的中性粒细胞增多，表明 C3a 可能是PDT 诱导炎症和免疫反应中的关键效应分子22 。 1.3 热休克蛋白（heat-sh
17、ock protein，HSP） PDT 引起的氧化应激可诱导 HSP70 的表达，Gomer 等23分别应用光敏素、单天门冬酰基二氢卟酚（mono-L-aspartyl chlorin-e 6，NPe6）和红紫素衍生物 SnET2 作为光敏剂，对小鼠 RIF-1 肿瘤进行PDT 治疗，反转录-PCR 结果显示肿瘤中 HSP70 mRNA 含量均升高。研究发现,HSP 作为信号分子介导了 PDT 后补体编码基因转录上调。Stott 等24将小鼠肿瘤相关巨噬细胞与 PDT 治疗后的小鼠 Lewis 肺癌细胞共同培养，发现 C3、C5、C9 mRNA 水平升高，而应用抗体阻断 HSP70 后，C9
18、 基因转录完全抑制，C3、C5 基因的转录也被明显抑制。研究显示 PDT治疗后，小鼠 SCCVII 肿瘤细胞表面 HSP70、HSP60 和糖调节蛋白94（glucose regulatory protein 94，GRP94）的表达升高，HSP70 分泌增加，PDT 治疗后的 SCCVII 细胞与巨噬细胞混合培养，可诱导巨噬细胞表面表达 HSP70 和 GRP94，并刺激其生成 TNF-，应用抗体阻断 HSP70功能，抑制了巨噬细胞 TNF- 的产生，提示 HSP70 可能参与 PDT 后炎症及免疫反应的调节25 。 1.4 花生四烯酸代谢产物 外界刺激因素可激活磷脂酶 A2(phospho
19、lipase A2，PLA2)，代谢膜磷脂生成花生四烯酸，再通过环氧化酶(cycloxygenase，COX)和脂氧化酶(lypoxygenase，LOX)途径，分别产生前列腺素(prostaglandin，PG)、血栓素（thromboxane，TX）和白细胞三烯(eukotriene，LT)等，发挥多种生理及病理作用。光氧化损伤可诱导生成大量花生四烯酸代谢产物，Cecic 等15对小鼠 EMT6 肿瘤行光敏素-PDT 治疗，发现阻断PGE2、TX、LT、组胺、凝血因子以及 IL-1、IL-6 等功能，均可抑制PDT 后血液中性粒细胞增多，认为这些促炎因子构成网络，共同调节 PDT后炎症反应
20、。研究发现 PDT 可引起血管内皮损伤、血栓形成，破坏微血管导致肿瘤坏死26 ，放射免疫检测示 PDT 后荷软骨肉瘤大鼠血清中 TX水平迅速升高，PDT 前 3 h 应用吲哚美辛，使 TX 释放明显减少，并完全抑制 PDT 后的微血管损伤和肿瘤消退，提示 TX 介导了 PDT 的血管效应27 。Hendrickx 等28研究发现人类 T4 膀胱癌细胞系经金丝桃素-PDT 后，胞质中钙离子浓度迅速升高，激活钙依赖性 PLA2，分解膜磷脂产生花生四烯酸，促进癌细胞凋亡；另一方面 PLA2 又可激活 p38 MAPK-COX-2 级联反应，诱导 COX-2 表达上调，代谢花生四烯酸生成 PGE2，刺
21、激血管内皮细胞迁移，并抑制癌细胞凋亡。Ferrario 等29也发现光敏素-PDT（能量密度 200 J/cm2，功率密度 75 mW/cm2）后，小鼠 RIF 肿瘤中 COX-2 表达上调，引起 PGE2 合成及分泌增多，VEGF 表达升高;应用选择性 COX-2 抑制剂 NS-398 减少了 PDT 诱导的 PGE2 和 VEGF，肿瘤治愈率提高。表明 PDT 后 COX-2 源性 PGs 可诱导肿瘤新生血管生成，促进肿瘤生长，而 COX-2 抑制剂通过抗血管生成作用增强了 PDT 疗效。 2 联合应用免疫效应分子的激活物或抑制剂对肿瘤 PDT 的增效作用 2.1 联合应用免疫效应分子或其
22、激活物对肿瘤 PDT 的增效作用 PDT 与许多免疫效应分子或其激活物联合应用，可增强疗效、减少治疗后复发。Bellnier 等30研究发现，PDT(1.5 mg/kg 光敏素剂量)前2 h 给予低剂量的 TNF- 诱导药物二甲基磺醌醋酸，较两者单独应用产生更为明显的肿瘤区坏死和血管数量减少，并可抑制肿瘤细胞再增殖，提高治愈率，但未增加正常组织的毒性。Krosl 等31应用基因转染技术制备了可持续生成粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF）的小鼠 SCCVII 肿瘤细胞，经 50 Gy X 线照
23、射后，分别于 PDT 前 48 h、PDT 后即刻及 48 h 3次瘤周注射，明显提高了 SCCVII 肿瘤的治愈率，这种 GM-CSF 治疗对外周血白细胞数量无明显影响，但可增强肿瘤相关巨噬细胞的细胞毒活性。研究还显示,IL-6 基因转染的小鼠 Lewis 肺癌细胞经 NPe6-PDT 治疗后凋亡增加，提示 PDT 联合 IL-6 治疗可能增强疗效32 。联合应用补体激活剂也是改善 PDT 疗效的有效方法。Korbelik 等33研究发现小鼠Lewis 肺癌 PDT 治疗后，立即瘤内注射酵母多糖或静脉应用链激酶或尿激酶，可引起肿瘤组织中 C3 水平升高，MAC 沉积增多，明显降低肿瘤复发率。
24、PDT 后联合应用补体旁路途径激活剂 -菊糖，显著提高了小鼠MCA205 纤维肉瘤中 CD8+细胞毒性 T 细胞的比例，PDT 高度抵抗性小鼠B16BL6 黑色素瘤经上述治疗后，肿瘤复发时间延长 3 倍多，PDT 前再加用小剂量 -干扰素，可进一步延缓复发，个别肿瘤甚至治愈34 。 2.2 抑制某些免疫效应分子对肿瘤 PDT 的增效作用 PDT 也诱导某些负性免疫效应分子表达上调，Gomer 等35发现光敏素-PDT 诱导了肿瘤微环境中 VEGF、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）和 COX-2 相关的 PG 表达增多，而靶向抑制这些血管生成和促生存因
25、子，可改善 PDT 疗效。Ferrario 等36研究发现小鼠 BA 乳腺癌细胞系 PDT 后，联合应用选择性 COX-2 抑制剂塞来考昔和 NS-398，使细胞凋亡增加；这种联合治疗未增加 BA 移植瘤的凋亡，但抑制了 PDT 后肿瘤组织中 IL-1、VEGF、PGE2 及 MMP-9 等因子的升高，肿瘤复发率明显降低，提示 COX-2 抑制剂体外通过诱导凋亡、体内通过减少炎症及促血管生成因子增强 PDT 效应。Makowski 等37也发现小鼠 C-26 结肠腺癌细胞系 PDT 后 COX-2 表达增加，C-26 移植瘤 PDT 后应用选择性 COX-2 抑制剂尼美舒利，明显抑制肿瘤生长，
26、荷瘤鼠生存率提高。研究发现 PDT 前 1 h 及 PDT 后 23 h，联合应用血管生成抑制剂 IM862 或EMAP-，可抑制 PDT 后小鼠 BA 肿瘤中 VEGF 升高；自 PDT 前 1 h 至 PDT后第 9 天，每日腹腔注射 IM862 或 EMAP-可明显降低复发率38 。尚有研究显示小鼠 BA 移植瘤 PDT 后，血管内皮细胞和肿瘤局部浸润的巨噬细胞 MMP-9 分泌增加，联合应用 MMP 抑制剂普啉司他，肿瘤治愈率显著提高39 。 3 结 语 肿瘤 PDT 可引起多种免疫效应分子的变化，介导宿主局部及全身反应，影响 PDT 疗效。目前已在体外和动物实验水平进行了大量研究，但这一过程的分子机制、PDT 后免疫效应分子间相互作用的网络、光敏剂种类和靶细胞类型对此过程的影响等问题，尚需进一步阐明，同时应加强临床研究进行验证。相信对 PDT 后免疫效应分子变化及作用的深入研究，将为优化临床 PDT 治疗提供有效方法。 【参考文献】
