1、P2X 嘌呤受体在初级伤害性感受中的作用【摘要】 P2X 嘌呤受体(P2X 受体)为配体门控阳离子通道，可表达于与伤害性信息传递有关的初级传入神经元的胞体、中枢端和外周端. 在外周 P2X 受体参与对伤害性和非伤害性刺激的反应；在脊髓背角，表达于突触前背根神经节神经元上的 P2X 受体激活后可易化谷氨酸的释放，参与脊髓背角的突触可塑性变化. P2X3 亚单位只高度选择性表达于感觉神经元，应用 P2X3 受体反义寡核苷酸、基因敲除技术和选择性拮抗剂A317491 的研究表明 ATP 和 P2X3 受体参与并调制伤害性信息的传递.【关键词】 P2X 受体；ATP；感受器，感觉；神经元，传入；脊髓0
2、 引言P2 嘌呤受体是多种细胞共有的一类膜受体，能选择性地与胞外ATP 结合，产生不同生物效应. 根据药理学特征被分为 P2X 及 P2Y 受体，采用分子生物学技术，已有七种 P2X 受体亚型（P2X17）及八种 P2Y 受体亚型被克隆（P2Y18）. 近来研究证实，伤害性感受器有丰富的 P2X 嘌呤受体的表达，特别是 P2X3 受体亚基的克隆，它只高度选择性表达于感觉神经元，因此 P2X 嘌呤受体在伤害性信息传递过程中的作用逐渐受到研究者的重视. 1P2X 嘌呤受体的一般特性P2X 嘌呤受体（P2X 受体）广泛分布于全身的各组织，包括神经元、神经胶质细胞、免疫细胞，以及心脏、血管、呼吸系统、
3、胃肠道、泌尿生殖系统的平滑肌细胞. 对 P2X 受体亚基的分子结构进行分析，发现 P2X受体只具有两个跨膜结构 M1 和 M2，氨基端和羧基端均在细胞内. 功能性的 P2X 受体主要由同源二聚体构成. P2X 受体与其他配体门控离子通道的激活一样，不需要经过膜和胞内信号转导过程，而是通过蛋白质构型的改变直接控制离子通道的状态，对小的阳离子如 Ca2+, Na+, K+等为非选择性通道. 最近研究发现 P2X 受体与其他递质的受体离子通道相比有较高的 Ca2+离子通透性1. 此外，P2X 受体的功能还受许多因素调控，如胞外 pH 值、二价阳离子和单价离子的变化可调节 P2X 受体对 ATP 的结
4、合（Li 等，1997）.2P2X 嘌呤受体在初级传入神经的分布与功能采用原位杂交技术证明，P2X16 受体 mRNA 在背根神经节（DRG） 、三叉神经节和结状神经节上均有转录，DRG 和三叉神经节中 P2X3 受体mRNA 的表达水平显著高于其他受体亚型（Collo 等，1996）. 新生期大鼠用辣椒素处理后，其成年期 DRG 细胞 P2X3 受体转录水平显著下降，表明 P2X3 受体表达于与伤害性感受有关的小直径神经元中（Chen 等，1995）. 免疫细胞化学研究发现，P2X16 受体均可见于 DRG 神经元但以P2X3 受体为主，在鼠的 DRG 和三叉神经节神经元中有近 40%的细胞
5、呈P2X3 受体免疫阳性反应，主要为小到中等直径的神经元，这些受体高度表达在与凝集素 IB4 结合及对胶质细胞源性神经生长因子（GDNF）敏感的细胞上，很少见于对神经生长因子（NGF）敏感的降钙素基因相关肽（CGRP）能和 P 物质（SP）能细胞（Bradbury 等，1998；Novakovic 等，1999）. 尽管 P2X2 受体免疫阳性反应在 DRG 神经元也可观察到，但其表达水平显著低于 P2X3 受体，有些神经元可见 P2X2 和 P2X3 受体的共同表达.电生理研究表明，ATP 及其类似物 meATP 可使 40%95%的大鼠离体 DRG 神经元引发内向电流（Burgard 等，
6、1999）. 这种反应主要表现为三种形式： 快速瞬间内向电流，此种电流失活快，持续时间小于100 ms. 慢失活电流，发生和失活均较慢，持续 12 s. 瞬间和持续电流的复合型. 有研究发现，在表达 P2X3 亚单位的 HEK293 细胞，ATP 引发的快速内向电流可被其拮抗剂阻断2 ，同时在 P2X3 受体基因敲除小鼠的 DRG 神经元也未观察到这种瞬间内向电流3 ，表明 P2X 受体引发的瞬间快失活电流是由 P2X3 受体的同源寡聚体亚单位形成的. 慢失活电流的反应形式与 P2X2 和 P2X3 亚单位在异源性系统中共表达相类似，可能是由 P2X2/3 的异源二聚体所介导，但是这种通道的精
7、确亚单位组成尚不清楚.P2X 受体不仅在初级传入神经元的胞体有功能性表达，而且这些受体能双向转运至背根和外周神经. 在大鼠和小鼠光滑皮肤内的各类感觉神经纤维也可见 P2X3 受体免疫阳性反应（Vulchanova 等，1998）. 在体和离体电生理研究表明 P2X 受体激动剂可选择性兴奋初级传入感受单位. 在人的皮内注射 ATP 后可见腓神经 C 类单位传入放电增加，这些感受单位多为热敏单位4. Dowd 等在大鼠关节传入神经也发现，关节腔内给予 ATP 和 meATP 后，50%的 C 多型伤害感受单位和 65%的 A 机械伤害感受单位传入放电显著增加，这种兴奋效应可被全身给予 P2X 受体
8、拮抗剂 PPADS 抑制，用弗氏佐剂诱发慢性关节炎后，ATP 及其类似物的效应未见显著变化（Dowd 等，1998）. 但也有报道，慢性炎性痛模型形成后，ATP 在 DRG 神经元激发的内向电流较对照组增加 23 倍5. 在离体大鼠隐神经标本上，ATP 和 meATP 主要兴奋 C 机械热伤害感受单位，低阈值的 A 机械感受单位和 Dhair 感受单位对 ATP 和 meATP 均不起反应，而在皮肤用角叉菜胶致炎后，伤害感受单位对 ATP 和 meATP的反应性均显著增强6 ，表明 ATP 可选择性兴奋初级传入伤害感受单位，可能为一种内源性致痛物质.3P2X 嘌呤受体在脊髓的分布与功能在脊髓背
9、角 P2X2, 3, 4, 6 受体 mRNA 均有表达. P2X4 受体主要分布于脊髓背角内的胶质细胞4. P2X3 受体阳性结构从 DRG 神经元轴突末梢进入背角的层深部，然而这种阳性反应在行背根横断术或选择损毁 IB4 阳性感觉神经后消失（Bradbury 等，1998） 7,8 ，可见 P2X3 受体主要分布于与脊髓背角神经元形成突触的 DRG 神经元中枢端.Gu 等在 DRG 和脊髓背角神经元共培养模型发现，表达于突触前DRG 神经元上的 P2X 受体激活后可易化谷氨酸的释放（Gu 等，1997）. Nakatsuka 等9在脊髓薄片制备研究发现，突触前的 P2X 受体激活可使脊髓背
10、角的自发性兴奋性突触后电流（EPSCs）增加，表明突触前的P2X 受体调节从初级传入神经元到脊髓背角的感觉传递. 在脊髓背角的不同部位，P2X 受体的调节作用表现为不同的模式. 在对伤害性和非伤害性刺激均产生反应的背角 V 层，激活突触前的 P2X 受体可诱发长时程的谷氨酸释放增加. 而在主要对伤害性刺激产生反应的背角层，激活 P2X受体则产生瞬时的谷氨酸释放增加10. 类似研究也发现，在培养的感觉神经元上形成的突触中 P2X 受体调节的谷氨酸释放可根据培养状态的不同，表现为长时程或瞬时释放反应（Labrakakis 等，2000）. 这些调制模式的不同可能是由于 P2X 受体亚单位在初级传入
11、神经元中枢端的不同功能性表达形成的. 在脊髓背角层，P2X 受体拮抗剂 PPADS 可改变脉冲激发的 EPSCs 比例（Li 等，1998）. 在背角层，中枢端的 P2X 受体激活可使 A 初级传入神经元形成的突触传递作用增强9. 这些结果与激活 P2X 受体引起中枢端谷氨酸的释放相一致，释放的谷氨酸可能进一步诱发脊髓背角NMDA 受体介导的突触可塑性变化. 因此，P2X 受体调节的突触传递增强可用来解释中枢敏化机制，即增强背角神经元对外周感觉传入的反应. P2X 受体除增强初级传入神经元中枢端和背角神经元之间的兴奋性突触联系外，在 GABA 能神经末端的 P2X 受体激活后也可加强与背角神经
12、元间的GABA 能抑制性突触传递（Hugel 等，2000）. 因此，ATP 对感觉传递和背角神经元的兴奋性的调节将取决于 ATP 的作用部位和对兴奋性、抑制性突触之间作用的平衡.初级传入神经元中枢端的 P2X 受体除了调节谷氨酸的释放外，可能还调节 P 物质和其他神经肽的释放. 免疫化学研究发现，有些表达 P2X受体亚单位的感觉神经元同时可见 SP, CGRP 和生长抑素的表达（Petruska 等，2000）. 培养的 DRG 神经元胞体和轴突在给予 ATP 后，可见 SP 以钙依赖方式排出，而且 ATP 的这种效应可被 P2X 受体拮抗剂PPADS 和苏拉明所抑制，表明激活 P2X 受体
13、可致 DRG 神经元 SP 的释放. 与此相一致的脊髓薄片研究也发现，ATP 和 meATP 可使脊髓背角神经元 SP 受体（NK1）内化，也提示激活中枢端的 P2X 受体可致初级传入神经元中枢端的 SP 释放，因为只有释放 SP 才可使 NK1 内化11 ，说明内源性 ATP 可能调节神经肽能感觉信息传递. 4P2X 嘌呤受体对伤害性感受的调制大鼠爪部注射 meATP 或 ATP，可观察到剂量相关的急性伤害性感受反应. 用辣椒素预处理后，再注射 meATP 不再出现伤害性感受反应，表明这种反应是由辣椒素敏感的伤害性感觉神经元参与形成的，这与免疫组织化学研究所表明的 P2X3 受体和辣椒素受体
14、（VR1）在感觉神经元中共存的结果相一致（Guo 等，1999）. 已有研究表明，在福尔马林实验中，脊髓鞘内给予 P2X 受体拮抗剂苏拉明、PPADS 和 TNPATP，能明显减轻福尔马林的自发痛行为（Tsuda 等，1999）. 预先鞘内给予 P2X受体选择性拮抗剂 PPADS 可剂量依赖性抑制大鼠足底皮下注射蜜蜂毒引起的持续伤害性感受，表明脊髓 P2X 受体参与蜜蜂毒诱发的持续痛行为（Zheng 等，2000）. 但也有研究报道，鞘内给予苏拉明和 PPADS 不能减轻某些神经病理痛模型的触诱发痛（allodynia） （Liu 等，2000；Stanfa等，2000） ，其原因可能为 P2
15、X 受体在神经病理痛的诱发时发挥作用，而在维持神经病理痛时作用较小；也可能是部分参与神经病理痛的 P2X 受体亚单位对苏拉明和 PPADS 不敏感. 近来研究发现，在神经损伤引起的触诱发痛模型中，P2X4 受体在损伤神经同侧的脊髓表达显著增加，脊髓鞘内给予 P2X4 受体反义寡核苷酸可降低神经损伤时 P2X4 受体的诱导且可抑制触诱发痛. 正常大鼠鞘内给予表达有 P2X4 受体的小胶质细胞，可产生触诱发痛，说明神经损伤的触诱发痛有小胶质细胞上的 P2X4 受体参与12.近年来采用遗传学及开发特异拮抗剂等方法对 P2X3 受体亚单位在痛觉调制中的作用进行了深入研究. 大鼠脊髓鞘内给予 P2X3
16、受体反义寡核苷酸（ASOs） ，DRG 神经元 P2X3 亚单位的表达水平显著降低. ASOs 可显著减轻由弗氏佐剂（CFA） 、福尔马林和 meATP 引起的伤害感受行为，而由角叉菜胶诱发的急性炎性痛模型中，ASOs 不影响其伤害性行为13. 在神经结扎形成的神经病理痛模型中，给予 ASOs 2 d 内可显著降低触诱发痛，而在 7 d 后恢复到对照水平14. 由此可见，慢性炎性痛模型和神经病理痛大鼠鞘内给予 ASOs 后，均可抑制和逆转机械痛敏化的形成，而且痛敏化的减轻与 P2X3 受体的下调相一致，表明 P2X3 受体参与了慢性病理痛敏化的形成. 在 P2X3 基因敲除小鼠，其初级传入神经
17、和 DRG 没有 P2X3 受体表达，福尔马林实验中可见自发痛行为降低，但Cockayne 等15发现完全弗氏佐剂诱发的热痛敏却加强，同时膀胱充盈感觉受到影响16. 近来研究发现，P2X3 同源二聚体和 P2X2/3 异聚体的高度选择性拮抗剂 A317491 可明显减轻由弗氏佐剂、福尔马林及结扎神经诱发的各种痛过敏反应. 在 L5L6 脊神经结扎形成的神经病理痛模型中，A31741 的作用弱于坐骨神经慢性结扎模型17. P2X3 亚单位在感觉神经元上的选择性表达，以及 P2X3 受体反义寡核苷酸、基因敲除技术和选择性拮抗剂 A317491 的应用，均表明 ATP 和 P2X3 受体在神经病理痛
18、和慢性炎性痛的形成和维持中发挥重要作用.P2X 受体在一些典型痛模型中反应性增强的细胞机制尚不清楚，目前的研究主要有以下几方面. 在急性痛模型中炎性介质可加强 ATP 对 C和 A 类神经元上 P2X 受体的作用，如 P 物质和缓激肽可增强重组 P2X3和 P2X2/3 受体引发的内向电流，P2X 受体的这种增强作用为非竞争性的，可能是由于 P 物质或缓激肽受体激活后通过胞内转导，从而使 P2X 受体N 端 PKC 位点的胞内磷酸化所致，最近又有研究表明炎性痛敏时 P2X 受体活性的增强，与初级感觉神经元的细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated prot
19、ein kinase, ERK）信号转导通路的激活密切相关18. 此外，炎性介质可改变初级传入神经元的反应表型，如一些寂静伤害感受器的激活. 这种急性痛反应发生时间很短，不可能使受体由胞体合成后转运到中枢与外周端，因此这种短时程反应可能是由于受体的反应特性发生变化形成的，即已表达的受体恢复了对 ATP 的敏感，或胞体内的受体快速插入到胞膜表达19. 在慢性痛中 P2X3 受体激动剂的长时程反应，可能是由 P2X3mRNA 和受体蛋白的表达水平发生改变形成的14. 在坐骨神经横断和脊神经结扎后小直径 DRG 神经元上 P2X3 阳性反应显著降低（Bradbury 等，1998） ，而在坐骨神经慢
20、性结扎和三叉神经的分支齿下神经部分损伤模型中其阳性反应却增加，表明 P2X3 受体在损伤神经元表达下调而未受损神经元则上调（Novakovic 等，1999）. 与此相一致的是 Tsuzuki 等20用原位杂交方法研究发现，横断某些神经的分支后，P2X3 受体 mRNA 在损伤的 DRG 神经元显著降低而在邻近未受损神经元却表达增加. 然而 P2X3 受体的表达和神经元损伤程度之间的具体关系尚不清楚. 综上所述，P2X 受体存在于不同类型的初级传入神经元和脊髓背角，在伤害性感受的外周以及中枢机制中发挥了不同的作用. 在外周 P2X 受体参与对伤害性和非伤害性刺激的反应，在脊髓水平，初级传入神经
21、中枢端的 P2X 受体可以调节神经递质的释放和参与脊髓背角的突触可塑性变化. 在对伤害性感受的调制中 P2X3 亚单位也发挥了重要作用. 因此，深入研究 P2X 受体在初级伤害性信息传递过程中的作用机制，不仅有助于认识外周神经网络及初级感觉中枢对机体功能的调节作用，也能为临床疼痛治疗提供新的思路. 【参考文献】1Egan TM, Khakh BS. Contribution of calcium ions to P2X channel responses J. J Neurosci, 2004;13:3413-3420.2North RA. The molecular physiology o
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