1、逆转录病毒介导 PTEN 基因抑制人肝癌细胞系的生长【关键词】 ,肝肿瘤 关键词: PTEN 基因;肝肿瘤;基因转染 摘 要:目的 研究外源性 PTEN 基因对人肝癌细胞系 HHCC 的细胞周期、增殖及裸鼠致瘤能力的影响，探索肝癌基因治疗新途径. 方法 将携有 PTEN 基因的真核表达载体体外转染 HHCC 细胞，筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养，以免疫组化方法检测 PTEN 基因的表达情况，应用流式细胞仪、电子显微镜、生长曲线测定等方法研究 PTEN 基因对肝癌细胞周期、超微结构、生长速率等特性的影响，并观察导入人 PTEN 基因对HHCC 细胞裸鼠致瘤能力的影响. 结果 稳定转染 PTEN
2、 基因的 HHCC 肝癌细胞中 PTEN 蛋白稳定表达，细胞周期明显改变，细胞从 G1 期到 S 期发生抑制，细胞超微结构有退行性改变，细胞增殖活性下降 70.6%裸鼠致瘤能力抑制率 72.2%. 结论 转染外源性 PTEN 基因可阻止 HHCC 肝癌细胞由G1 期进入 S 期，并抑制肿瘤细胞增殖. Keywords:PTEN;hepatocellular carcinoma;gene transfer Abstract:AIM To investigate the suppressive effects of ex-ogenous PTEN gene on HHCC hepatocellul
3、ar carcinoma cell line and to probe new methods of gene therapy for hepatocel-lular carcinoma.METHODS A eukaryotic expression vector containing PTEN gene was transfected into human HHCC cell under mediation of lipofectamine，and positive cell clones were selected and amplified.Expression of PTEN gene
4、 was detected by in situ immunohistochemistry.Flow cytometry，electron microscope were adopted to measure the effects of PTEN on cell cycle，ultrastructure，and cell growth of the transfected HHCC，as well as on tumorigenicity in nude mice.RESULTS PTEN was expressed in the HHCC trans-fected with PTEN ge
5、ne by in situ immunohistochemistry.The progression of cell cycle was arrested from G1 to S phase.Compared with the parent HHCC cells，the growth of cells transfected with PTEN gene in vitro and in nude mice were dramatically inhibited by70.6%and72.2%，respectively.CONCLUSION HHCC hepatoma carcinoma ce
6、lls could be arrested at G1 /S phase and the growth of cells could be significantly suppressed by exogenous PTEN gene. 0 引言 肝癌是世界性的常见恶性肿瘤，具有发病率高、发展快、转移早、生存期短、预后差等特点.目前治疗方法效果尚不理想，人们纷纷把目光转向基因治疗.PTEN 基因是 1997 年 3 个小组同时发现的定位于人体第10q23 染色体上的肿瘤抑制基因1 .它在多种恶性肿瘤中发生杂合性缺失（LOH）或突变，在肝癌中亦有 27%发生 LOH2 .我们将外源性人PTEN
7、基因导入不表达该基因的 HHCC 肝癌细胞系中，探讨其对肝癌细胞系的细胞周期、超微结构及恶性增殖的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 人肝癌细胞系 HHCC（本校病理学教研室购自上海细胞工程中心）;RPMI1640 培养基、胰蛋白酶（Hyclone）;小牛血清（杭州四季青生物公司）;脂质体 lipofectamine2000（Gibco）;嘌呤霉素（Clon-tech）;pBP-PTEN 及 pBP 质粒（美国 Ludwing 癌症研究所 Frank B.Furnari 博士惠赠）;DH5 大肠杆菌菌株（本校生物化学教研室保存）;各种限制性内切酶（Clontech）;鼠抗人 PTEN mAb
8、（Santa Cruz）;SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）;6wk 龄 BALB/c 裸鼠（第四军医大学实验动物中心）. 1.2 方法 携有人 PTEN 基因的真核表达载体 pBP-PTEN 及不含该基因的空载体 pBP 转化 DH5 菌株，挑选具有氨苄青霉素抗性的克隆并扩增，以碱裂解法提取并纯化质粒 DNA.EcoR单酶切及 Spe和 Hind双酶切，10gL -1 琼脂糖凝胶电泳鉴定.HHCC 细胞在 37，含 50mLL-1 的潮湿空气的条件下，培养于青、链霉素浓度均为 105 UL-1 的100mLL-1 小牛血清-RPMI1640 培养基中.基因转染采用脂质体介导法（参照 l
9、ipofectamine2000 说明）将 pBP-PTEN 和 pBP 质粒分别转染入处于对数生长期的肿瘤细胞.筛选培养基中嘌呤霉素浓度为0.5mgL-1 ，维持筛选 15d，加压筛选 7d，挑选阳性细胞克隆，扩增培养.将分别成功转染 pBP-PTEN 和 pBP 质粒的 HHCC 细胞命名为HHCC-pBP-PTEN 和 HHCC-pBP 细胞.未转染细胞作为阴性对照.用免疫组化方法检测 PTEN 蛋白在上述 3 种细胞中的表达情况.一抗为鼠抗人 PTEN 蛋白 mAb，1100 稀释，4过夜，加入 2 抗，室温孵育 30min，加入 SABC复合物，DAB 显色，苏木素衬染.以磷酸盐缓冲
10、液代替一抗作为阴性对照.3 种细胞分别经 2.5gL-1 胰蛋白酶消化成单细胞悬液，各取约1106 个细胞，无菌 PBS 洗涤细胞 2 遍，以预冷的无水乙醇固定后，流式细胞仪进行细胞周期检测.3 种细胞各约 1106 ，经胰酶消化，1000rmin-1 离心 5min，细胞沉淀以戊二醛固定 2h，常规包埋，切片，电子显微镜下观察.3 种细胞经 2.5gL-1 胰蛋白酶消化成单细胞悬液后，接种于 24 孔板，每种细胞接种 7 孔，每孔约 4103 个细胞，每日取 1 组细胞进行计数，绘制细胞生长曲线.取 16 只 6wk 龄BALB/c 裸小鼠，随机分为实验组和对照组，每组 8 只.在其右大腿上
11、部sc0.1mL 经 1640 培养基重悬的肿瘤细胞，细胞数量约为 1106 ，其中实验组注射 HHCC-pBP-PTEN 细胞，对照组注射未转染 HHCC 细胞.连续观察肿瘤的生长，并测量肿瘤直径. 统计学处理:数据以 SPSS 统计软件包进行 t 检验. 2 结果 EcoR单酶切将含 PTEN 基因的 pBP 质粒切为约 1.2kb 和 5.1kb 的两条带，而将空 pBP 仅切为 5.2kb 的一条带.Spe和 Hind双酶切将 pBP-PTEN 切为约 2.3kb 和 4.0kb 两个片断，将空 pBP 切为约 1.1kb 和 4.1kb两个片断（Fig1）. 2.1 PTEN 基因转
12、染肝癌细胞 采用脂质体介导法，成功将 pBP-PTEN和 pBP 质粒转染入 HHCC 肿瘤细胞，经嘌呤霉素维持筛选 14d 后出现阳性克隆， 加压筛选 7d 获得稳定转染的阳性细胞克隆，相差显微镜下 HHCC-pBP-PTEN 和 HHCC-pBP 细胞与对照组相比，细胞形态无明显改变.免疫组化结果显示:HHCC-pBP 和 HHCC 细胞 PTEN 蛋白表达阴性，而 HHCC-pBP-PTEN 细胞表达阳性，可见胞质中大量棕黄色颗粒（Fig2）. 图 1 略 2.2 转染 PTEN 基因对 HHCC 人肝癌细胞的影响 流式细胞仪检测细胞周期，可见转染 PTEN 基因后，细胞从 G1 期到
13、S 期发生抑制（Tab1）;透射电镜下可见 HHCC-pBP-PTEN 细胞内有退行性改变，线粒体肿胀，棘突紊乱，断裂，数量减少，内质网明显扩张成池状，且含有较大的次级溶酶体（Fig3）;3 种细胞生长曲线测定可见 HHCC-pBP-PTEN 细胞生长曲线平缓，生长速度较另两种细胞明显降低（Fig4）.接种瘤细胞 1wk 后，两组裸鼠右腿上部皮下均出现肉眼可见的瘤结节，约 5wk 后可见两组瘤结节大小有明显差异，HHCC-pBP-PTEN 组肿瘤平均直径为（5.01.5）mm，HHCC 细胞组肿瘤平均直径为（18.04.5）mm，抑制率72.2%（Fig5）. 表 1 流式细胞仪显示细胞周期变
14、化 略 3 讨论 Guldberg 等3 检测了 35 例恶性黑色素瘤中 PTEN 的突变，发现26.0%为部分或完全同源型缺失，17.0%为合并等位基因缺失的突变，提示恶性黑色素瘤中 PTEN 基因的缺失或突变可能是其发生和发展的重要机制.Kawamura 等2 报道肝癌中 27.0%（25/89）发生杂合性缺失.我室先前的研究也证实肝癌中 30.0%不表达 PTEN 蛋白，PTEN 蛋白在人 HHCC细胞系中也不表达.但有关外源性 PTEN 基因对该基因缺失的肝癌细胞系的作用方式及作用机制的研究尚未见相关报道.我们通过逆转录病毒用脂质体转染的方法将外源性的 PTEN 导入 HHCC 人肝癌
15、细胞系中，免疫组织化学染色证明其在 HHCC 中获得稳定表达，这为进一步研究其在肝癌发生、发展中的生物学效应奠定了基础.将 PTEN 基因体外转染 HHCC 肝癌细胞系，筛选稳定转染的细胞克隆后做相关检测，结果证实稳定转染 PTEN 基因的HHCC 肝癌细胞周期明显改变，细胞从 G1 期到 S 期发生抑制，细胞超微结构有退行性改变，细胞增殖活性及裸鼠致瘤能力显著降低.这为进一步探讨 PTEN 基因与肝癌的关系奠定了基础. 图 2 图 3 略 PTEN 产生其生物学效应的机制尚无完全定论，目前认为，PTEN 蛋白是一种双特异性蛋白酪氨酸磷酸酶，它可使磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3 ）去磷酸化成为，而
16、 PIP3 是胰岛素、表皮生长因子等这类细胞生长因子的信号传递分子，而且 PIP3 通过蛋白激酶 B （PKB）抑制细胞凋亡和通过其他效应分子刺激细胞增殖.PTEN 减少 PIP3 ，导致细胞增殖抑制和细胞凋亡3 .PTEN 尚有脂性磷酸酶活性，可能也有重要作用4 .另外相关研究已经发现 PTEN 的 N 末端区有一段与细胞骨架蛋白-tensin 同源，可能通过抑制局灶粘附激酶的磷酸化，进而抑制整合素介导的细胞扩展和局部粘附而抑制肿瘤的侵袭和转移5，6 . 图 4 图 5 略 PTEN 基因是与肝癌发生和发展密切相关的一种抑癌基因，将其导入到该基因缺失的肝癌细胞系中，明显地抑制肿瘤细胞的增殖，
17、这为肝癌的基因治疗提供了实验理论依据7，8 . 参考文献: 1Li DM，Sun H.TEP1，encoded by a candidate tumor suppressor locus，is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta J.Cancer Res，1997;57（11）:2124-2129. 2Kawamura N，Nagai H，Bando K，Koyama M，Matsumoto S，Tajiri T，Onda M，Fujimoto J，Ueki T，Ko
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