1、神经损伤引发实验大鼠痛觉及初级感觉神经元的电生理变化【摘要】 目的:研究神经损伤后，大鼠的痛觉行为改变及初级感觉神经元的电生理变化。方法:用大鼠慢性压迫性神经损伤(Chronic Constriction Injury, CCI)的痛觉实验模型，正常大鼠为对照，观察大鼠的热痛敏行为；以胞内电生理记录法检测损伤神经元及正常神经元的膜电位特征及其变化。结果：模型组大鼠的损伤侧肢体的缩腿反应潜伏期较对照侧明显缩短；损伤神经元的静息膜电位移向去极化方向且激发动作电位所需阈强度减小。结论：神经损伤可引起大鼠的热痛敏行为，损伤神经元有异位自发放电产生，其兴奋性增加是行为异常的主要成因。【关键词】 慢性压迫
2、性神经损伤；热痛敏；异位自发放电；阈强度疼痛在正常生理状况下, 对机体有一定的保护作用，使机体在遭遇损伤性刺激时及时避开。疼痛又是很多疾病的共同表现,炎症、神经损伤、肿瘤、糖尿病等均可引起疼痛。目前,人们对疼痛产生机制的研究给予了越来越多的关注。本文用慢性压迫性神经损伤(Chronic Constriction Injury, CCI)的痛觉模型，观察了大鼠在神经损伤后的痛觉行为改变，并且在体、胞内记录了初级感觉神经元的电生理特性，以探讨疼痛的成因，该方法能准确、直观地反映神经元的功能状态，国内文献报道很少。1 材料与方法1.1 慢性痛动物模型的建立 本研究的实验动物为SpragueDawle
3、y （SD）大鼠，雌雄不拘,体重 180 g250 g，由中国医学科学院动物研究所提供，该动物所具有国家等级标准。以 1%戊巴比妥钠40 mg/kg 经腹腔注射麻醉大鼠，依据 (Bennett and Xie 1988) CCI 模型的制作方法1 ，在大鼠左侧大腿中部暴露坐骨神经, 以 40# 铬制羊肠线疏松结扎坐骨神经，力度以下肢肌肉出现轻微抖动为准, 共结扎 4次，结扎点之间相距 1 mm。结扎后逐层缝合肌肉和皮肤，术后给予青霉素预防感染。1.2 热痛过敏的行为学测试 将 CCI 大鼠 (在术后 4 d20 d 内) 放在热痛刺激仪的玻璃 铝合金架上,待大鼠安静后，用同一强度的伤害性热源分
4、别聚焦大鼠的左右两侧足后跟，记录两腿回避收缩的潜伏期(claw withdrawal latency,CWL)。正常侧的缩腿反射潜伏期通过调节一般控制在 12 s 左右，当缩腿反射潜伏期超过 20 s 时，切断电源以避免损伤大鼠的皮肤。实验时每侧重复 3 次，间隔 10 min15 min，取平均值。1.3 电生理记录 (electrophysiological record)方法 在 CCI模型鼠(在术后 4 d20 d 内)和对照鼠（假手术鼠）的 DRG (dorsal root ganglion) 神经元上进行在体电生理记录。大鼠在戊巴比妥钠腹腔麻醉后, 以电热毯维持体温在(371)。首
5、先游离出一段靠近损伤区中枢端的坐骨神经,以备安装刺激电极进行轴突刺激，以测定神经元的传导速度。之后手术暴露 L4 或 L5 神经节。用双脊髓钳把拟记录的脊髓段牢固地固定在大鼠的定位仪上，在解剖显微镜下用钟表镊除掉部分神经节的神经外膜及神经束膜，使神经元突显在显微镜视野下。神经节用温度接近37的生理盐水浸润。微电极电阻在 20 M40 M, 内充 3 m 的 KCl溶液, 电极银丝 (包括记录电极和参考电极) 预先经 AgCl 泛极化处理。微电极由推进器脉动向前移动，推进器步长设置为 3 m,电极插入神经元后，其膜电位信号经微电极放大器（MEZ8201, Nihon Kohden corpora
6、tion）并联输入示波器和 BL420 生物信号处理硬件系统, 经BL420 系统软件呈现在计算机显示屏上。神经元稳定 2 min 后, 进行以下一系列操作：一，给以阶梯式递增的胞内去极化电流刺激,电流幅度：0.1 nA6 nA，波宽：200 ms，频率：0.1 Hz。找出激发神经元动作电位（action potential, AP）的阈强度 (rheobase), 阈强度指诱发 AP 所需的最小胞内刺激电流强度。二，给坐骨神经以不同强度的电压刺激, 经轴突激发神经元产生动作电位。电压幅度 1 V50 V，波宽：0.01 ms，频率：0.1 Hz。记录信号经 3 kHz 高频滤波, 可储存于计
7、算机中, 用于实验后的统计与分析。实验结束后对所记录的 DRG 神经元进行统计分析, 根据动作电位波型, AP 峰的持续时间(APD,duration of AP, ms) 和传导速度（conduction velocity，CV，m/s）将 DRG 神经元分为A 、A 和 C 三类。 本文对于静息膜电位 (rest membrane potential, Vm) 45 mV 以下, 动作电位幅度60 mV A 和 A类神经元留用，而 C 类小神经元静息膜电位在40 mV 以下,动作电位幅度50 mV 时留用。对留用的神经元进行以下几方面的分析和测量：测量神经元的静息膜电位；观察神经元静息膜电
8、位时有无自发放电；对动作电位的几个参数进行测定，包括: a，APD：AP 峰高的中点部位之间的时间距离, 又称半峰宽； b，AP 峰的幅度（AP amplitude，mV）：指AP 峰顶和基线（即 VR 水平）之间的电位差；c，超极化后电位（AHP）幅度（AHP amplitude： AHPA，mV）指 AHP 谷底和基线（即 VR 水平）之间的电位差； d, AHP 的持续时间（AHP duration：AHPD，ms）: AHP 峰高的中点部位之间的时程, 又称 AHP 的半峰宽。1.4 实验数据的处理和统计学分析 资料的处理和统计分析用BL420 生物信号处理软件, Microsoft
9、Excel, SPSS 统计软件。所有实验数据以 meansSD 来表示，n 指所测定的神经元的数目。用 Students 双尾 ttest 检验进行统计分析。P0.05 被定义为有统计学差异(介值为 0.05)。2 结果2.1 CCI 大鼠在神经损伤后表现出热痛敏行为 图 1 示 CCI 大鼠术后 3 d、5 d、7 d、9 d 的热痛敏行为测试结果，可见损伤侧缩腿反应潜伏期较对照侧明显缩短，差异具有统计学意义，并且在术后第 7 天缩腿反应潜伏期最短。大鼠损伤侧肢体间或有快速的激惹性抬腿动作，表明 CCI 大鼠处于自发性疼痛及热痛敏状态中。图 1 CCI 大鼠的热痛觉过敏行为（n=15） （
10、略）2.2 神经损伤后导致神经元兴奋性增加 电生理实验中,共计从L4 或 L5 DRG 神经节中记录到 320 个神经元，其中 73 个神经元来自正常对照组, 247 个神经元来自 CCI 大鼠即实验组。来自 CCI 大鼠神经元的自发性 AP 的发生率为 35.2,对照组自发性 AP 的发生率为 12.7,CCI 组明显高于对照组，表明神经损伤后兴奋性增加。对来自两组大鼠中的一些神经元的动作电位参数进行了测试，各项测试结果见表 1 和表 2。表 1为正常组动作电位参数的测试结果，表 2 为 CCI 实验组动作电位参数的测试结果。比较表 1 与表 2 两组神经元的 AP 参数，发现在 CCI 组
11、 DRG 的三类神经元的静息膜电位值都比正常神经元绝对值减小，可见损伤的 DRG神经元静息膜电位移向了去极化方向。CCI 组三类神经元引发动作电位所需阈强度均小于对照组，差异具有统计学意义，表明 CCI 组神经元兴奋性增加。表 1 正常组动作电位参数的测试结果（略）3 讨论大鼠坐骨神经损伤后, 损伤侧肢体表现出自发性疼痛及热痛敏行为，对于这种现象的成因有多方面的研究报道。病理研究发现在神经损伤部位神经结构发生了质的变化，局部神经轴突发生炎症及脱髓鞘，部分轴突发生断裂，断端神经纤维中枢端发芽生长，自身缠结形成神经瘤，来自神经瘤的神经纤维中或神经元胞体可记录到大量异位自发放电，特别是 C 类纤维的
12、放电2 。也就是说自发放电并不是来自正常的神经末梢感受器的传入而是来自神经瘤或神经元胞体，称为异位自发放电。这种不带编码性质的、无序的、长期自发电活动,不断轰击脊髓神经元,导致神经病理性痛，如痛觉过敏、触诱发痛、自发性痛等3，4 。异位自发放电正是神经病理性痛的主要成因，我们的结果也表明损伤神经元的异位自发电活动较正常神经元增加。正常神经元之所以产生自发电活动，可能是手术过程中对其造成的损伤所引起。损伤神经元自发电活动增加是其兴奋性增强的表现。实验中我们还观察到损伤神经元静息膜电位移向去极化方向,使静息膜电位距离阈电位的差值减小, 因而激发动作电位所需的阈强度减小，动作电位易于引发。兴奋性增强
13、的成因主要是由于神经损伤后，一方面神经纤维发生了炎症、脱髓鞘、芽生和神经瘤等病理改变；另一方面，离子通道、受体和载体的合成、运输和动态调整也受到影响，其膜插入出现故障，大量的钠、钙、钾通道以及受体和载体异位堆集在胞体、神经瘤、脱髓鞘部位和芽生部位，重塑了膜电特性，导致异位自发放电起博点形成58 。因而在神经损伤部位及神经元胞体产生了大量的异位自发电活动，引起实验大鼠的痛觉过敏。【参考文献】1 Bennett G J, Xie Y K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation lik
14、e those seen in manJ. Pain,1988,33:87107.2 Wall P D, Gutnick M. Properties of afferent nerve impulses origenating from a neuromaJ. Nature,1974,248:740743.3 Xie Y, Zhang J, Petersen M, et al. Functional changes in dorsal root ganglion cells after chronic nerve constriction in the ratJ. J Neurophysiol
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