1、转化生长因子【关键词】 ,转化生长因子 【Abstract】 AIM: To study the effects of transforming growth factor1 (TGF1) antibody on endothelin 1 (ET1) and nitric oxide (NO) in hepatic stellate cells (HSC). METHODS: Suspended liquid of cells at a density of 1108/L was plated in culture dish under 37, 50 mL/L CO2 for 24 h, an
2、d divided into groups as follows (4 dishes in each group): control group; TGF1 antibody (5-20 mg/L) group, and continuously cultured for 24 h. The culture supernatant was collected. Nitric oxide synthase (NOS) activity was measured using colorimetry, NO level was determined by nitrate reductase tech
3、nique, and ET1 content in the medium was surveyed by enzyme linked immunosorbant assay (ELISA) method. RESULTS: TGF1 antibody markedly inhibited HSC ET1 secretion in a doseeffect manner, and ET1 contents in control group, 10, 15 mg/L TGF1 antibody groups were （8.500.46 ）, （5.330.27） and （3.690.33） g
4、 /L respectively, with significant difference in multiple comparison between different dosage groups (P0.05). Simultaneously, as TGF1 antibody dose increased, iNOS activity and NO synthesis increased, which in control group, 10, 15 mg/L TGF1 antibody groups were （1.940.16）, （3.290.42）, （3.880.32） ku
5、/L and （46.754.72）, （80.685.44） ， （88.582.84） mol/L respectively. CONCLUSION: TGF1 antibody could decrease ET1 level and increase NO content in HSC. 【Keywords】 transforming growth factor1; hepatic stellate cells; endothelin; nitric oxide 【摘要】 目的: 研究转化生长因子 1 (TGF1)抗体对肝星状细胞（HSC）分泌一氧化氮（NO）和内皮素 1（ET1）的影
6、响. 方法: HSC以1108/L的密度接种于细胞培养皿中，37，50 mL/L CO2条件下培养24 进行以下分组实验，每组重复 4个培养皿： HSC空白对照组； HSC+TGF1 抗体. TGF1 抗体为 520 mg/L，继续培养 24 . 取培养上清液，用硝酸还原酶法测定 NO水平，化学比色法测定一氧化氮合成酶(NOS)活性，酶联免疫吸附（ELISA）双抗体夹心法检测 ET1含量. 结果: TGF1 抗体能明显抑制 HSC分泌 ET1，且随着抗体剂量的增加 ET1含量降低，对照组、10，15 mg/L TGF1 抗体组分别为（8.500.46） ，（5.330.27）, （3.690.
7、33）g /L，且各剂量组之间两两比较差异均有统计学意义(P0.05)；随着 TGF1 抗体剂量加大，iNOS 活性和 NO的合成增加，对照组，10，15 mg/L TGF1 抗体组分别为（1.940.16） ， （3.290.42） ， （3.880.32） ku/L 和（46.754.72） ，（80.685.44） ， （88.582.84） mol/L. 结论: TGF1 抗体能降低 HSC ET1水平，增加 NO含量. 【关键词】 转化生长因子 1 抗体；肝星状细胞；内皮素；一氧化氮 0 引言 肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）活化不仅是肝纤维化的细
8、胞学基础，而且活化 HSC的收缩是门脉高压的细胞学基础. 目前认为，一氧化氮（NO） 、内皮素 1(ET1)是调节 HSC收缩与舒张的重要因素1.HSC 的活化是通过各种细胞因子经旁分泌或自分泌途径作用的结果，其中转化生长因子 1 (transforming growth factor1, TGF1)是最关键的因子2. 因此，本研究试图应用 TGF1 抗体作用于体外培养的大鼠 HSC，观察 TGF1 抗体对 HSC分泌 NO和 ET的影响，探讨TGF1 与其它细胞因子间的关系，从而为本病探索一条可能的治疗途径. 1 材料和方法 1.1 材料兔抗 TGF1 抗体(美国 Santa Cruz Bi
9、otechnology, Inc)；RPMI1640培养基(美国 Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；胰蛋白酶消化剂(美国 Sigma公司)；NO 测定试剂盒、NO 合成酶(iNOS)测定试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)；酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(深圳晶美生物有限公司)；兔抗 ET1多抗(北京中山生物技术公司). 1.2 方法 1.2.1HSC 的培养 HSC株 CFSC由美国 Greenwel教授建株并惠赠，其表型为活化的 HSC,从 CCl4诱发的肝硬化大鼠中分离并通过培养使细胞自发获得永生性3. 将冷冻保存于液氮中的 HSC复苏后接种于含 10 mL/L胎牛
10、血清、105 U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素的 RPMI1640培养液中, 37， 50 mL/L CO2条件下培养. 当细胞呈单层致密状时，2.5 g/L胰蛋白酶消化后传代. 1.2.2TGF1 抗体处理 HSC细胞同步化处理后进行以下分组，每组重复 4个培养皿. HSC 空白对照组；HSC+TGF1 抗体. TGF1 抗体分别为 5，10，15，20 mg/L，继续培养 24 . 1.2.3NO 水平、iNOS 活性及 ET1含量测定取培养上清液，采用硝酸还原酶法测定 NO水平，化学比色法测定 NOS活性，ELISA 双抗体夹心法检测 ET1含量，具体操作按试剂盒说明书进行. 统
11、计学处理： 所有资料以 xs表示， 使用 SPSS 11.5统计软件包，多组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)， 最小差值显著法(LSD)作多重比较. 2 结果 2.1TGF1 抗体对 HSC ET1的影响对照组活化的 HSC能分泌大量的ET1，TGF1 抗体能明显抑制 HSC分泌 ET1，而且随着剂量的增加 ET1含量降低. 不同剂量 TGF1 抗体处理的 HSC，其 ET1含量均低于对照组(P0.05)，且各剂量组之间两两比较差异均有统计学意义(表 1). 表 1TGF1 抗体对肝星状细胞 ET1，iNOS 和 NO的影响（略） aP0.05 vs对照 ; bP0.05
12、 vs 5 mg/L TGF1 抗体； cP0.05 vs 10 mg/L TGF1 抗体；dP0.05 vs 15 mg/L TGF1抗体. 2.2TGF1 抗体对 HSC iNOS，NO 的影响体外培养的 HSC能分泌一定量的 NO，TGF1 抗体增加 HSC的 iNOS活性，使 NO的合成与分泌增加，不同剂量组与对照组比较差异均有统计学意义，随着 TGF1 抗体剂量加大，iNOS 活性和 NO的合成增加，但 20 mg/L与 15 mg/L TGF1 抗体组比较差异无统计学意义(P0.05)，表明 20 mg/L TGF1 抗体达到增加 HSC的 iNOS活性和 NO的合成最大效应(表
13、1). 3 讨论 肝纤维化的形成机制较为复杂，多种细胞因子对其发病起着重要作用，单一细胞因子并非孤立发挥作用，各种细胞因子通过自分泌和旁分泌彼此相互作用，形成细胞因子网络，共同调控肝纤维化的发生和发展. TGF1 是有关纤维化的细胞因子网络中重要因子，与其它细胞因子有着广泛而复杂的联系. 近年来发现 HSC的收缩与舒张在调节肝窦阻力及微循环中具有重要作用，与肝硬化门脉高压症的发生及发展密切相关. HSC的舒、缩功能受自主神经与血管活性介质的调节，目前备受关注的是 ET和 NO. ET是调节 HSC收缩的一种最重要的活性物质4 ，激活的 HSC是产生 ET1的主要细胞. NO 是精氨酸在 NOS
14、的作用下生成的，HSC 表达诱导型 NO(iNOS)合成酶5 ，NO 对 HSC收缩和收缩蛋白产生有影响，能阻断 ET引起的 HSC收缩，有明显的舒张 HSC作用. 有报道 TGF1 可刺激活化的 HSC分泌ET16,为此，本研究拟观察抗 TGF1 抗体阻抗 TGF1 作用后，HSC内 NO 和 ET1变化. 实验表明，活化的 HSC能自分泌 NO和 ET，具有 iNOS活性. TGF1抗体能抑制 HSC分泌 ET1，提示 TGF1 抗体可能通过抑制 HSC分泌ET1，从而抑制其收缩，使肝内阻力降低. 相反, TGF1 抗体能明显增加HSC iNOS活性，培养上清液 NO水平增加. 这种情况下
15、，推测一方面 NO对 HSC的舒张作用增强，另一方面，内源性 NO阻断 ET，引起 HSC收缩的作用也减弱，其结果是肝内阻力及门静脉压力降低. 肝内的实际情况则涉及更加复杂的多细胞、多因子的参与. TGF1 在肝纤维化的形成过程中起着非常重要的作用，因此从细胞因子水平寻求有效的抗纤维化治疗药物，中断某些介质或因子对 TGF1的初始合成，用细胞因子抗体阻断细胞因子的作用，拮抗 TGF1 作用成为治疗肝纤维化的新途径. 目前， 这些治疗方法仍然处于理论和体外实验、 动物实验阶段. 关于在人体及全身水平上细胞因子间相互作用及细胞因子网络对肝纤维化的影响， 有待做更深一步的研究. 【参考文献】 1 G
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