1、草木犀石油醚提取物对 NFB 和血红素氧合酶 1 表达的影响作者：庞然, 张淑玲, 赵雷 , 刘双林, 董继华, 陶君彦 【摘要】 目的: 探讨草木犀的石油醚提取物在炎症中的作用。方法: 通过 LPS 干预 RAW264.7 细胞系建立炎症细胞模型, 免疫细胞化学法检验NFB 的表达及分布变化, 实时荧光定量 RTPCR 法检测血红素氧合酶1（HO1 ）的基因表达, Western blot 法测定 HO1 的蛋白表达量。结果: 免疫细胞化学法结果显示药物干预时胞质被染为棕色, NFB 多分布在胞质未被激活; 仅有 LPS 干预时, 胞核被染为棕色, NFB 集中分布在细胞核表达增强。药物提取
2、物干预后 HO1 的 mRNA 表达水平明显升高, 且呈剂量依赖型关系; Western blot 结果显示药物干预后 HO1 的蛋白表达水平也明显升高。结论: 草木犀的石油醚提取物通过抑制NFB 的激活, 同时促进 HO1 的释放而发挥一定的抗炎作用。 【关键词】 草木犀; 石油醚; RAW 264.7 细胞系; NFB; 血红素氧合酶 1草木犀, 豆科(Leguminosae)草木犀属(Melilotus) 1 年生或 2 年生草本植物, 是临床用于抗炎的一种中草药。然而, 草木犀产生抗炎作用的分子生物学机制还不明确。本实验中拟通过 LPS 刺激 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞系建立炎症
3、细胞模型1, 并采用免疫细胞化学法、 实时荧光定量 RTPCR 法Western blot 法对草木犀提取物在炎症中的作用进行的研究。1 材料和方法1.1 材料 RPMI1640、 TRIzol 购自 Gibico 公司; LPS(Escherichia coli O111: B4)和 MTT 购自 Sigma 公司; HO1 羊抗鼠多克隆抗体购自 RD Systems 公司; 兔抗鼠多克隆抗体 NFB p65 IgG 抗体购自 Santa Cruz 公司; MMLV 逆转录酶、 dNTP 购自Promega 公司; SYBR Green 购自 Biotium 公司; Oligo(dT18)及
4、引物由Invitrogen 公司合成。草木犀于 2006 年 8 月在陕西陇县采集, 经陈科力教授（湖北中医学院）鉴定后保存于湖北中医学院药学部的植物样本库中。小鼠巨噬细胞系 RAW 264.7 购自中国典型培养物保藏中心。1.2 方法1.2.1 草木犀石油醚提取物的制备 取 50 g 风干的草木犀磨成粉末, 用 700 mL/L 乙醇于 85提取 3 次(1 次 500 mL, 每次 1.5 h), 真空过滤浓缩提取液, 用去离子水稀释至 1 g/mL（药材水）浓度。取 5 mL 浓缩液至 100 mL 的分液漏斗中, 连续石油醚提取直至其干重达 0.425 g。用 RPMI1640 培养液
5、将其稀释成 3 种浓度 10 mg/L、 5 mg/L 和 1 mg/L 备用。1.2.2 细胞培养 小鼠巨噬细胞系 RAW264.7 使用 RPMI1640 培养液（加入 100 U/mL 青霉素, 100 mg/L 链霉素和 100 mL/L 胎牛血清）, 50 mL/L CO2 培养箱中 37培养。1.2.3 细胞模型的建立和干涉 LPS 处理前 24 h 将细胞接种于6、 24 或 96 孔板上, 24 h 后细胞贴壁后弃上清, 加入含 LPS10 g/L 的培养液和不同浓度的提取物, 作用不同时间后收集细胞, 分别使用免疫细胞化学法, 实时荧光定量 RTPCR 法, Western
6、blot 法检测。1.2.4 实验分组 实验共分 4 组。(1)阳性对照组: 地塞米松(DM) 0.5 g/L 作阳性对照; (2)阴性对照组: 黄芪多糖(APS)100 mg/L 作为阴性对照; (3)空白对照组: 只用 10 g/L 的 LPS 处理而不加药物干预; (4)正常对照组: 不用 LPS 处理也不加药物干预。1.2.5 药物细胞毒性的检测 用 MTT 法, 在终止细胞培养前 4 h加入 20 L MTT 溶液（浓度 5 g/L, pH7.4）, 终止细胞培养后每孔加入 150 L DMSO, Spectramax 250 全自动定量绘图酶标仪测定 A490 值。细胞病变效应（c
7、ytopathic effect, CPE）检测 , 细胞在提取液中培养24 h 后在显微镜下观察细胞形态以检测细胞病变。1.2.6 NFB 的检测 利用免疫细胞化学法(SP)检测 NFB的表达及分布变化。将盖玻片置于培养板中, 并将细胞接种于培养板, 待细胞爬片后, 药物干预细胞 2 h。PBS 洗涤, 4丙酮固定 10 min; 30 mL/L 过氧化氢甲醇溶液孵育 20 min 以封闭内源性过氧化物酶; 10 mL/L Triton X100 37 5 min, PBS 洗涤; 加入山羊血清室温孵育 20 min; 然后加入兔抗鼠多克隆抗体 NFB p65 IgG 抗体（1200）, 4
8、冰箱过夜, PBS 洗涤; 加入二抗（生物素化羊抗兔 IgG, 1400）, 37 30 min, PBS 洗涤; 加入 HRP 结合链霉亲合素（1400）, 37 30 min, PBS 洗涤; DAB/H2O2 显色, 苏木素衬染, 常规脱水、 透明、 封片。1.2.7 血红素加氧酶 1 mRNA 水平的检测 实时荧光定量 RTPCR法检测 HO1 的基因表达。细胞干预 18 h 后提取 RNA 检测 HO1 的基因表达量。细胞总 RNA 提取采用 TRIzol 试剂提取法, 具体方法参照说明书。将 RNA 保存在-80备用。采用 ABI7700 序列检测仪。引物序列: MusHO1: F
9、orward: 5CACAGATGGCGTCACTTCGTC3, Reverse: 5GTGAGGACCCACTGGAGGAG3 。Musactin: Forward: 5 GCTACAGCTTCACCACCACAG 3, Reverse: 5 GGTCTTTACGGATGTCAACGTC 3 。RNA 经逆转录反应合成 cDNA, RT 及PCR 反应体系按试剂盒说明书进行。实验结果采用 ABI7700 自带软件对数据自动分析后, 用所给 Ct 值应用公式 Folds = 2-Ct 进行基因表达差异分析2 。1.2.8 HO1 蛋白水平的检测 Western blot 法检测细胞中药物干预前
10、后 HO1 的蛋白表达量的变化。细胞干预 24 h 后, 冷 PBS 洗涤, 加入细胞裂解液, 冰上孵育 15 min, 细胞刮刮下并收集裂解液, 10 000 r/min 4 10 min, 取上清保存于-20。用 BCA 法测定蛋白质浓度, 取相同量蛋白质用于 100 g/L SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳; 转移至硝基纤维素膜 50 g/L 脱脂奶粉溶液 37 封闭 1 h; 羊抗鼠 HO1 多克隆抗体(1200) , 4孵育过夜, 洗膜; 应用辣根过氧化物酶标记的二抗（1200）室温孵育 1 h, 再加入化学发光显色剂显色, X 光片曝光显影, 凝胶成像分析系统扫描, pro3.0 软件半
11、定量分析。1.2.9 统计学分析 应用 SPSS12.0 统计分析软件包, 采取单因素方差分析对实验数据进行处理, 以 P0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 药物对细胞的毒性 MTT 实验结果显示 3 种浓度（10 mg/L、 5 mg/L 和 1 mg/L）药物干预细胞 24 h 后对细胞活性没有明显影响。CPE结果亦如此（图 1） 。2.2 药物对 NFB 的抑制效果 免疫细胞化学法结果显示: 药物干预时, 胞质被染成棕色（图 2AC）, DM 干预时, 胞质被染成棕色（图 2D）, 表示 NFB 多分布在胞质未被激活; APS 干预时, 胞核被染成棕色（图 2E）, 仅有 LPS
12、干预时, 胞核被染成棕色（图 2F）, 表示NFB 集中分布在细胞核表达增强, 说明 APS、 LPS 能诱导其向细胞核转位, 使 NFB 活化。2.3 药物干预前后 HO1 的 mRNA 水平 药物提取物干预后HO1 水平明显升高, 并且药物浓度越高, HO1 水平越高, 呈现一个剂量依赖型关系（图 3） 。2.4 药物干预前后 HO1 的蛋白水平 Western blot 结果显示药物干预后 HO1 的蛋白水平明显升高（图 4）, 之间的差异有统计学意义(P0.01)。3 讨论巨噬细胞在炎症的启动过程中起着非常关键的作用, 它通过激活机体的免疫系统, 释放细胞因子、 具有生物活性的脂类介质
13、及活性氧等一系列炎症介质参与炎症反应3 。根据其对炎症反应的促进或抑制效应的不同, 这些炎症介质大致上可分为两类: 促炎介质和抗炎介质, 两者的比例关系及动态变化是决定炎症转归的关键因素4 。当细胞面临有毒性的化学物质或病原体侵袭的时候, 机体的免疫系统会释放出NFB 。NFB 是调控众多炎症基因表达的关键转录因子, 其通常以非活性状态存在于细胞质中, 当细胞受到 TNF、 弗波脂等刺激时, NFB 得以活化并从细胞质易位到细胞核, 启动多种炎症基因表达, 使大量的炎性细胞浸润于炎症部位5 。NFB 发生核转位是一些免疫和炎症反应的重要步骤, 应用 NFB 抑制剂以减少炎症介质的产生成为治疗炎
14、症的新思路。炎症反应过程中, 在炎症介质产生的同时抗炎因子 HO1 也被分泌和活化。HO1 是催化血红素降解的限速酶, 从而生成胆绿素、 游离铁和 CO。研究表明, 它们不仅能清除机体的活性氧, 还能抑制多种促炎介质的产生, 促进多种抗炎介质的表达, 并且拮抗一些炎症介质的细胞毒效应6 。本课题组的前期研究已证实, 草木犀石油醚提取物能通过抑制促炎介质和细胞因子 TNF 、 IL1 、 IL6 、 NO 的产生发挥抗炎作用。而这些促炎介质和细胞因子都受 NFB 的调控, 这就提示草木犀石油醚提取物可能通过抑制 NFB 信号通路而抑制 LPS 所致巨噬细胞高水平表 TNF 、 IL1 等发挥抗炎
15、作用。本实验显示 LPS 刺激细胞后NFB 得以活化并向核内转位, 而药物干预后 NFB 以非活性状态存在于胞质中未被激活, 进一步证实了草木犀石油醚提取物能通过抑制NFB 活化发挥抗炎作用。同时, 草木犀石油醚提取物也对抗炎介质产生一定的影响。实验显示草木犀石油醚提取物能促进 HO1 的表达和释放, 且该作用呈剂量依赖性。以上结果表明, 草木犀石油醚提取物能通过抑制 NFB 活化, 同时, 促进 HO1 的基因表达和释放而发挥抗炎作用。本实验选用 DM 和 APS 分别作为阳性和阴性对照。DM 是传统的抗炎药物; APS 是临床上用于增强免疫的免疫调节剂, 能够增强促炎因子的释放7 。结果显
16、示, 一定浓度的 DM 可以显著降低 NFB 活化, 而 APS则没有这方面的作用, 这与文献报道的结果基本一致8 。我们从分子水平探讨了草木犀石油醚提取物的体外抗炎活性及其可能的分子机制。通过本研究发现, 草木犀石油醚提取物能抑制促炎介质的表达, 并促进抗炎介质的表达, 使得促炎/抗炎介质的比例偏向抗炎一方, 从而产生广泛的抗炎作用。【参考文献】1 Kim KM, Kwon YG, Chung HT, et al. Methanol extract of cordyceps pruinosa inhibits in vitro and in vivo inflammatory mediato
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