1、HLA-DRB1 基因分型与慢性乙型肝炎的相关性研究【关键词】 慢性乙型肝炎 摘要 :目的 探讨 HLA-DRB1 等位基因多态性与慢性乙型肝炎之间的关系。 方法 采用聚合酶链反应、反向特异性序列寡核苷酸探针（SSO）基因分型技术结合 Luminex 液态芯片技术对 81 例慢性乙型肝炎患者和 90 例正常人的 HLA-DRB1 等位基因进行分型比较。 结果 HLA-DRB1 等位基因 0901 型在慢性乙型肝炎的等位基因频率明显高于对照组（33.33%、15.56%） ，两者相比差异有显著性（ 2 =7.40，P0.01，RR=2.71） ，而 HLA-DRB1 等位基因 0403 型在慢性
2、乙型肝炎的等位基因频率明显低于对照组（16.05%、35.56%） ，两者相比差异有显著性（ 2 =8.37，P0.01，RR=0.37）;其他型别的等位基因2 组间没有明显差别。 结论 HLA-DRB1 等位基因 0901 型与慢性乙型肝炎易感性密切相关，可能是慢性乙型肝炎的易感基因或连锁基因;HLA-DRB1 等位基因 0403 型与慢性乙型肝炎抗性密切相关，可能是慢性乙型肝炎的抗性基因。宿主的 HLA-DRB1 是乙肝病毒感染转归的重要因素。 关键词 :慢性乙型肝炎;HLA-DRB1 基因;聚合酶链反应;反向特异性序列寡核苷酸探针;Luminex 液态芯片技术;杂交 Abstract:O
3、bjective To investigate the association between chronic hepatitis B（CHB）and the polymorphism of HLA-DRB1.Methods The HLA-DRB1alleles in81patients with CHB and90normal control subjects were analyzed by using the polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotide probes（PCR SSOP）technique and
4、 the Luminex liquid CMOS chip.Results The frequency of HLA-DRB10901allele in the CHB group was markedly higher than that in the normal control group（33.33%vs15.56%，with significant correlation between them， 2 =7.40，P0.01，RR=2.71）;the frequency of HLA-DRB1*0403in the CHB group was lower than that in
5、the normal control group（16.05%vs35.56%，statistically sig-nificant， 2 =8.37，P0.01，RR=0.37）.No significant differences among the other alleles.Conclusion HLA-DRB10901is closely associated with the susceptibility to CHB，and may be the susceptible gene or linkage gene.HLA-DRB10403，in inverse proportion
6、 to the susceptibility to CHB，may be an oppositional gene.They two may regulate the outcome of the HBV infection in a victim. Key words:chronic hepatitis B;HLA-DRB1gene;polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotide probes（PCR SSOP）;hybridization 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染后可引起较广感染谱
7、，有的人感染后成为无症状携带者或隐匿性肝炎，有的表现为急性肝炎经过，有的则迁延不愈成为慢性肝炎，甚至发生肝硬化或原发性肝癌1 ，这些不同的临床转归是病毒、环境和宿主遗传因素三者相互作用的结果2-3 。许多研究表明，某些 HLA类分子或等位基因与 HBV感染的预后有密切关系4-5 。苏北地区是乙肝高发区之一，在乙肝患者中进行 HLA 类型分析研究以探讨其对 HBV 感染转归的影响很有必要。我们采用聚合酶链反应（PCR） 、反向特异性序列寡核苷酸探针（SSO）和Lu-minex 液态芯片技术对慢性乙型肝炎患者 HLA-DRB1 基因多态性分析，初步探讨 HLA-DRB1 与淮安地区汉族人群 HBV
8、 感染的相关性。现将结果报道如下。 1 资料和方法 1.1 研究对象 1.1.1 慢性乙型肝炎组 81 例慢乙肝患者血液标本取自淮安市第四人民医院肝炎科住院及门诊患者;其中男 65 例，女 16 例，男女比为 4.06;年龄 1770 岁，平均 35.8 岁。诊断符合第 10 次全国传染病与寄生虫学术会议修订的诊断标准6 ，并且排除有其他肝炎病毒感染者。 1.1.2 对照组 90 例对照血液样本来自淮安市血站本地汉族健康献血者，其中男 55 名，女 35 名，平均 36.5 岁（2147 岁） 。 1.2 方法 1.2.1 外周血单个核细胞 DNA 提取 采用全血 DNA 抽提纯化试剂盒（Pr
9、omega 公司） ，血液标本经 EDTA-Na 2 抗凝。严格按照试剂说明书操作。DNA 提取后用紫外分光光度计检测 DNA 含量，A 260 .A 280 为1.652.0。DNA 置-20冰箱保存。 1.2.2 PCR 扩增 所需引物根据第 13 届国际组织相容性世界大会（IHWG）确定的 HLA-DRB1 基因核苷酸序列，设计出扩增 DRB1 片段的通用引物，在适宜的反应体系（HLA 分型试剂盒含 PCR 反应液）中经TaqDNA 聚合酶催化，扩增 DRB1。PCR 扩增产物加样至含溴乙啶的 2%琼脂糖凝胶中电泳（图 1） 。用于 PCR 的模板 DNA 用灭菌双蒸水稀释，浓度大于 2
10、0g.L 即可。 图 1 PCR 产物电泳结果（略） M:Marker，S1 S 9 为 PCR 扩增样本 1.2.3 HLA-DRB1 基因分型 采用快码 HLA-SSO 基因分型试剂盒（上海复旦张江医药股份有限公司）及相关分型软件。 分型原理:将扩增后的 DNA 产物与耦联在荧光编码微球（以下简称Beads）上的 DNA 探针进行杂交。Beads 直径均为 5.6m，微球内部经 2种不同的红色分类荧光染色，根据这 2 种染料混合比例不同，得到 100种不同的颜色，Beads 就有了 100 种不同的地址，Beads 表面联有特异性寡核苷酸探针，探针经绿色荧光标记，由于 Beads 可标记为
11、 100 种，则可联上 100 种不同的探针，扩增后的 DNA 产物与 Beads 上的 DNA 探针进行杂交，不同型别的 DNA 结合到不同的探针上去。由于 Beads 可在特定的溶液中悬浮，由 Luminex 研制的 Luminex100 分析仪能使 Beads 排成单列通过检测通道，并使用双色激光同时对 Beads 内的红色分类荧光和 DNA探针上的绿色报告荧光进行检测。一束判定 Beads 的颜色来决定被测物的特异性（定性）;另一束测定 Beads 上 DNA 探针的荧光标记强度从而给被测物定量，将结果输入分型软件。 严格按试剂操作说明对扩增后的产物进行杂交、变性、中和、上机收集信号，
12、分析结果。 1.3 统计学处理 基因频率的计算采用直接计数法，2 组间等位基因分布的差异用四格表法进行 2 检验。相对危险性（RR）按 Woolf 公式计算:RR=ad.bc，a 为携带某一特定型别的病例数，b 为不携带某一特定型别的病例数，c 为携带某一特定型别的对照组人数，d 为不携带某一特定型别的对照组人数。 2 结果 慢性乙肝患者和正常对照者基因型比较见表 1。 表 1 慢性乙肝患者和正常对照者 HLA-DRB1 基因频率和相对危险性（略） GF:基因频率;AF:等位基因频率;RR:相对危险性;N 1 、N 2 分别代表正常人和慢乙肝患者检出的阳性等位基因数;0101-0103:010
13、1 与 0103本分型试剂不能区分，故作为一组统计，以下类似。 3 讨论 目前已经明确，HLA-抗原与多种疾病相关7 。有关 HLA-DRB1与 HBV 感染相关性的研究已在不同地区展开，并取得了一些进展，但是在不同地区人群中的研究结果并不一致:Hohler 等8 于 1997 年在高加索人群中研究发现，慢性乙肝的发生与 HLA-DRB11301.1302 型的表达呈负相关;Cotrina 等 9 对慢性乙型肝炎和急性自限性乙型肝炎患者HLA-DRB1 的基因型进行分析，进一步证实 HLA-DRB11301/1302 与清除HBV 感染有关，对防止 HBV 感染后慢性化起保护作用。本研究得出的
14、结论与贾宗剑等10 在广州地区研究部分结果相同，他用改进的套式 PCR-SSP 方法对 88 名无血缘关系慢性乙肝患者和 83 名该地区健康对照者进行HLA 分型，结果发现，HLA-DR9 和 DR14 可能为慢性乙肝的易感基因，而DR4 可能为慢性乙肝的抗性基因。 众多研究结果大多不同，究其原因，可能与感染 HBV 基因型不同，以及不同地区人群携带的 HLA 基因结构频率不同有关。由此可见，研究HBV 感染和 HLA-DRB1 的相关性应当充分考虑到地区人群间的差异，即最好在同一地区人群中研究二者的相关性。 本课题以江苏淮安地区汉族人群为研究对象，通过预实验，着重探讨 HLA-DRB1 与该
15、人群 HBV 感染的相关性。江苏省淮安地区汉族人群 HLA-DRB1 基因 09 型的携带率较高11 ，而本研究发现的 HLA-DRB1 等位基因 0901 型和 0403 型与淮安地区 HBV 感染相关（RR 值分别为 2.71 和0.37） ，可能会成为解释江苏淮安地区汉族人群是乙肝病毒（HBV）感染的高发人群的重要原因之一。 本研究结果提示:HLA-DRB1 等位基因 0901 型与慢性乙型肝炎易感性密切相关，可能是慢性乙型肝炎的易感基因或连锁基因;HLA-DRB1 等位基因 0403 型与慢性乙型肝炎抗性密切相关，可能是慢性乙型肝炎的抗性基因。说明宿主的 HLA-DRB1 是乙肝病毒感
16、染转归的重要因素。 参考文献 : 1 Lee WM.Hepatitis B virus infectionJ.N Engl J Med，1997，337（24）:1733-1745. 2 Chu CJ，Lok AS.Clinical significance of hepatitis B virus genotypesJ.Hepatology，2002，35（5）:1274-1276. 3 Thursz M.Genetic susceptibility in chronic viral hepatitisJ.Antiviral Res，2001，52（2）:113-116. 4 Thio CL
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