1、 淀粉样蛋白对小胶质细胞合成一氧化氮的影响作者：韩笑峰 吕丽 葛汝丽 唐荣华 【摘要】 目的 探讨 淀粉样蛋白(amyloid betapeptide, A)诱导小胶质细胞活化后 轻链核因子(nuclear factorkappa B, NFB) 的表达及一氧化氮(NO)水平的变化。方法 A 干预纯化培养的小胶质细胞，观察其形态学变化，采用镉还原法测定 NO水平，免疫细胞化学方法研究 NFB 的表达。结果 500 nmol/L及 1000 nmol/L A 干预组细胞形态呈“阿米巴样” ，细胞核内 NFB 的表达增加（P0.05） ，培养基中 NO浓度升高（P0.05） 。结论 A 激活小胶质
2、细胞 NFB 途径大量合成 NO，可能参与阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)的致病过程。 【关键词】 淀粉样蛋白 小胶质细胞 轻链核因子 一氧化氮 阿尔茨海默病 【Abstract】 Objective To study the morphological changes of microglial cell activated by amyloid betapeptide, the expression of nuclear factorkappa B increased in nucleus and the levels of nitric oxide in cu
3、ltural medium. Methods Purified microglial cells were intervened by amyloid betapeptide and the morphological changes were observed . The cadmiumreduction method was used to determine the levels of nitric oxide in culture medium, immunocytochemical method to investigate changes of nuclear factorkapp
4、a B. Results There were no statistical significant differences between the experimental group of 100 nmol/L amyloid betapeptide and the control group (P0.05). In the experimental groups of 500 nmol/L and 1000 nmol/L amyloid betapeptide, microglial cells were bigger, the expression of nuclear factork
5、appa B increased in nucleus and the levels of nitric oxide were higher in culture medium than control group (P0.05).Conclusion The amyloid betapeptide could participate in the processes of Alzheimers disease by inducing microglial cells to excrete nitric oxide. 【Key words】 amyloid betapeptide ，micro
6、glial cell，nuclear factorkappa B，nitric oxide，Alzheimers disease 阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)重要的病理特征之一是纤维状 淀粉样蛋白(amyloid betapeptide, A)在神经细胞外及脑血管壁沉积形成老年斑(senile plaques, SP)。大量研究表明，A 的沉积在 AD发病中起着关键作用，但其神经损伤的具体机制尚不完全清楚，研究提示，一氧化氮(nitric oxide, NO)可能与 A 的神经毒性有关。本研究用 A 干预小胶质细胞，观测 轻链核因子(nuclear factor
7、kappa B, NFB) 的表达以及 NO水平的变化，探讨 A 诱导小胶质细胞合成 NO的机制。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物：出生 3 d内的 Wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。 1.1.2 试剂：DMEM/F12 培养基、胎牛血清（购自 Hyclone公司） ，A140 、A142 （购自 SIGMA公司） ，胰蛋白酶、TritonX100 （购自 Amresco公司） ，小鼠抗大鼠 CD11b单克隆抗体（购自 Serotec公司） ，兔抗 NFB p65 多克隆抗体（购自 SANTA CRUZ公司） ，抗小鼠及抗兔SP试剂盒和 DAB显色试剂
8、盒（均购自北京中山生物技术有限公司） 。 1.2 方法 1.2.1 小胶质细胞分离、培养：在无菌条件下取出新生 Wistar大鼠的大脑，剥离脑膜，取大脑皮层，剪成 0.5 mm3碎块，加入 1 ml 0.125%胰蛋白酶室温消化，用 100目不锈钢筛网过滤，离心，弃上清，加入 DMEM/F12培养基重新悬浮细胞，接种于多聚赖氨酸包被的 50 ml培养瓶中，置于 37、含 5%CO2、20%O2 饱和湿度的培养箱中培养。原代混合胶质细胞培养 79 d后，在 37恒温摇床上以 250 r/min振速摇动处理 2.5 h，将细胞悬液接种到已放置盖玻片的培养皿中，37培养 1 h，弃未贴壁细胞，加新鲜
9、培养基，培养 57 d即可使用。用免疫细胞化学方法标记其特异性抗原 CD11 b进行细胞纯度鉴定，小胶质细胞比例占 90%以上即符合要求。 1.2.2 A 的“老化（aged） ”：用无菌三蒸水将 稀释成 0.5105 nmol/L，37孵育 1 周，使其变为聚集状态的 。 1.2.3 小胶质细胞的干预：培养皿中分别加入不同浓度的“老化”140 或142 ，对照组则不加，继续培养 24 h。收集培养基，-80保存，备测定 NO浓度。细胞爬片用甲醛固定 15 min，-20保存备用。 1.2.4 免疫细胞化学染色：免疫细胞化学染色采用 SP法。第一抗体小鼠抗大鼠 CD11b单克隆抗体的稀释度为
10、11 000，兔抗 NFB p65 多克隆抗体的稀释度为 1200，以 PBS替代一抗作阴性对照。联苯二胺（DAB）显色。NFB p65免疫细胞化学结果判断：在高倍视野下行细胞计数，细胞核有棕褐色颗粒着色为阳性，无棕褐色颗粒着色为阴性。并根据 Handel等2的分级标准半定量：-(5% )，+(5%25% )，+(26% 49% )，+ ( 50 % )。 1.2.5 NO测定：采用 Cortas NK等3的镉还原法测定 NO浓度。用不同浓度的 KNO3做阳性标准管，无标本管做空白对照。用 721分光光度计测定 OD值。计算标准曲线并换算 NO浓度。 1.2.6 统计学处理：数据资料应用 SA
11、S 6.12版软件进行统计学分析。等级计分结果比较采用 Ridit分析。计量数据以均数标准差（xs）表示，统计分析采用多个均数之间两两比较的 SNK检验。 2 结果 2.1 小胶质细胞鉴定及 A 干预后其形态学变化 经 CD11b免疫细胞化学染色，胞膜及胞浆染色的细胞即为小胶质细胞，其纯度达 92%(图1A，1B)。正常培养的小胶质细胞的形态特征为：胞体小，呈椭圆形或三角形，具有伸向各个方向的细小突起 (图 1A)。A 干预后小胶质细胞胞体变大，形态不规则。部分细胞有片状突起或伪足，呈“阿米巴样”(图1B)。 ( )所标记为小胶质细胞 图 1A 正常培养的小胶质细胞 CD11b免疫 细胞化学反
12、应及其形态(400)图 1B A 干预后小胶质细胞 CD11b免疫 细胞化学反应及其形态(400) 2.2 A 干预后 NFB 的表达变化 NFB 免疫细胞化学染色后，对照组细胞胞浆染色，而 A 干预组细胞除胞浆外，胞核及核周区域亦出现染色(图 2A，2B)。等级计分 Ridit分析，A142 和A140 500 nmol/L干预组与对照组比较差异有显著意义 (P0.05)，1 000 nmol/L组与对照组比较差异有极显著意义 (P0.01)，而 100 nmol/L组与对照组比较差异无显著性(P0.05)(表 1)。相应浓度的A142 干预组与 A140 干预组比较差异无显著性 (P0.0
13、5)。 图 2A 对照组小胶质细胞 NFB p65免疫 组化反应(400) 图 2B 1 000 nmol/L A42 干预后小胶质细胞 NFB p65免疫组化反应(400) 表 1 NFB p65免疫细胞化学结果及 Ridit分析 2.3 A 干预后培养基中 NO含量变化 100 nmol/L A140 、500 nmol/L A140 、100 nmol/L A142 干预组培养基中的 NO含量与对照组比较无显著差异(P0.05)；500 nmol/L A142 、1 000 nmol/L A140 干预组培养基中的 NO含量与对照组比较显著增高(P0.05)；1 000 nmol/L A
14、142 干预组培养基中的 NO含量增高与对照组比较有极显著意义 (P0.01) (表 2)。相应浓度的 A142 干预组与 A140干预组比较无显著差异(P0.05)。表 2 A 干预后培养基中的 NO含量比较 3 讨论 研究证明，NO 参与了 AD的病理过程并发挥重要的作用4 ，但 A诱导合成 NO的具体机制尚未完全阐明，Guo 等5报道其与 NFB 的信号转导和基因转录密切相关。 本实验结果显示， A 干预小胶质细胞后，核内 NFB 的表达增加，提示 NFB 被激活。NFB 是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，调控细胞因子、趋化因子、免疫受体、转录因子、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等
15、多种靶基因，参与炎症和免疫反应、细胞周期控制与分化、细胞凋亡、感染及应激反应，其在 AD的发病机制中具有重要的作用6 。静息状态下，NFB 与 NFB 抑制蛋白（IB）单体结合，以非活性状态存在于胞浆中。在外界因素的作用下，IB 快速降解，有 p50和 p65两个亚单位组成活化状态的 NFB 迅速转移入胞核，与靶基因的 B 序列结合启动基因转录。 目前认为，小胶质细胞表面有多种 A 结合的受体：清道夫受体(class A scavenger receptor, SR)、晚期糖化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)及甲
16、酰基蛋白受体（formyl peptide receptorlike 1，FPRL1）等，A 与受体结合后启动第二信使激活 NFB 途径79 ，而 NFB 如何被激活尚不清楚。可诱导的一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)基因是 NFB 调控的一个重要靶基因，被 A 激活的 NFB 转移入核，结合于 iNOS的启动子区的 NFB 反应元件，诱导 iNOS大量的表达，NO 产生增多10 。此与本实验结果一致，低浓度(5001 000 nmol/L)A 可激活小胶质细胞致 NO产生增多。 NO在中枢神经系统的神经传导、记忆和空触可塑性中发挥重要的
17、生理功能，而过量的 NO可通过多种途径损伤膜性结构、蛋白质及 DNA，导致神经元坏死或凋亡11 ；亦可介导和放大氧化应激、炎症级联反应，进而选择性损害与学习记忆有关的神经元，促进 SP的形成12 ，使 AD病理变化进行性发展。可以推论，A 的神经毒性机制之一是通过激活NFB 诱导 iNOS过表达而产生超生理剂量的 NO来发挥的。 因此，小胶质细胞的 ANFBiNOSNO 途径，可能在 AD过程中起着重要的作用，对此途径进行深入研究，可进一步揭示 AD发病机制以及为 AD的临床治疗提供理论依据。 【参考文献】 Giovannelli L, Casamenti F, Scali C,et al.
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