1、采用溶剂分散和挤压器联动装置制备阿霉素脂质体的稳定性研究【摘要】 目的： 考察溶剂分散和挤压器联动装置制备阿霉素脂质体制剂的稳定性. 方法: 使用联动装置制备空白脂质体,联动装置将阿霉素采用 pH 梯度法载药于空白脂质体中，评价其在体外不同影响因素下的制剂稳定性. 测定了阿霉素脂质体理化性质，用透析法检测阿霉素脂质体的药物包封率，用 HPLC 考察阿霉素脂质体在大鼠体内药代动力学行为. 结果: 该联动装置可使脂质体的制备工艺简化，投料成品一步完成，同时可在线监控粒径，采用此装置制备的脂质体阿霉素的粒径为（989 nm）,药物包封率为 98.3%. 结论: 溶剂分散和挤压器联动装置可用于工业化生
2、产阿霉素脂质体制剂, 设备实用性强, 产品质量可控性好. 【关键词】 脂质体；溶剂分散；挤压器；工艺学，制药 0 引言 阿霉素(doxorubicin)是蒽环类抗肿瘤药物, 可用于卵巢癌、乳癌等的治疗,但因毒性大,一般不作为首选药 1-2 . 因此，开发低毒性的新型阿霉素靶向制剂成为研究热点. 实验结果显示, 阿霉素脂质体制剂可以大幅度降低阿霉素的毒副作用，从而提高治疗指数1-2. 二十多年来，多种脂质体阿霉素制剂见诸于文献，但是脂质体药物制剂的大规模工业化生产仍然存在诸多需要解决的问题. 许多制备工艺由于包封率低，体内、外的稳定性低，特别在制剂批次间稳定性无法保证，而难以实现产业化. 我们从
3、阿霉素脂质体产业化的角度出发，利用溶剂分散和挤压器联动装置制备脂质体阿霉素制剂，通过对该制剂质量的考察，了解该装置对制备阿霉素脂质体的适用性和质量影响，同时也对该装置制备的阿霉素脂质体制剂在大鼠体内的血药浓度进行了评价. 1 材料和方法 1.1 材料雄性 SD 大鼠 18 只,体质量 180220 g,由第四军医大学实验动物中心提供，动物实验前禁食 12 h, 自由进水. 蛋黄卵磷脂，(EPC，纯度 98%),油酸(OA，纯度 99%)和胆固醇(Chol，纯度 99.5%)由西安力邦制药有限公司提供. 氯仿、异丙醇和甲醇为色谱纯（美国 Tedia公司） ，磷脂对照品（EPC）由德国 Lipoi
4、d 公司惠赠，纯度 99.8%. 盐酸阿霉素（美国 Sigma 公司） ，其他化学试剂都为分析纯. 挤压器(SWAGELOK, PATD316QC4 ，CAN)，其他联动装置的零配件都由西安力邦制药有限公司设计. 激光散射粒径仪 PSS NICOMP 380(Santa Barbara，Calif，USA)，P2000 液相色谱仪（美国 Thermo Seperation） ；N2000 色谱数据工作站（浙江大学） ；色谱柱，YMC PVA Silicon Gel， （4.6250 mm，5 m）Waters 公司. 1.2 方法 1.2.1 联动装置制备载药脂质体阿霉素首先称取 36.48
5、g 卵磷脂，12.06 g 胆固醇和 0.38 g 维生素 E 加入 60 mL 乙醇，加热至 45搅拌使之完全溶解后加入有机储液罐中，将 340 mL 的 400 mmol/L，pH 为 4 的柠檬酸溶液加入水溶液储液罐中，挤压器内置 3 层 100 nm 滤膜. 开动输液泵，将乙醇磷脂辅料溶液和柠檬酸缓冲液分别通过高效制备泵压入联动装置. 调节梯度泵使水相泵与有机相泵的流量比为 8515，收集并检测脂质体的粒径，如过大可将脂质体溶液重新泵入混合器和挤压器，最终可得粒径在（11030） nm 的脂质体溶液. 然后，将脂质体溶液经高压泵压入高压超滤透析柱，用 400 mmol/L，pH4 柠檬
6、酸缓冲液作为透析补充液将有机溶剂除去. 反复进行超滤透析过程即可得到用于 pH 梯度法载药的脂质体. 取 9 g/L 氯化钠注射液将盐酸阿霉素完全溶解. 将溶解好的盐酸阿霉素放缓冲液罐中加热至 5560. 将制备好的空白脂质体加入载药罐中，同时加入碳酸钠溶液，震摇 5 min. 最后加入温度为5560盐酸阿霉素溶液并剧烈振摇 2 min. 混合溶液在 5560平衡 10 min 后在室温条件下储存. 1.2.2 非联动装置制备载药脂质体阿霉素取适量的磷脂混合物和少量维生素 E 共溶于氯仿/甲醇（21，体积比） ，加入圆底烧瓶，旋转减压蒸发除掉有机溶剂形成均匀的混合磷脂薄膜，真空干燥过夜. 在含
7、有混合磷脂膜的圆底烧瓶内加入 300 mmol/L pH4 的柠檬酸钠缓冲溶液，快速震荡使磷脂膜水合溶解，可以间隔的将容器置于 55水浴中加热加快磷脂膜水合过程. 将得到的多层脂质体在 55用挤压器反复多次挤压通过双层 100 nm 孔径的薄膜，即得到所需的大单室脂质体. 用注射用水调节脂质体浓度至所需总磷脂并用 0.22 m 的滤膜过滤除菌，充氮，分装. 1.2.3 脂质体阿霉素的粒径测定取脂质体样品适量，去离子水稀释20 倍，用 PSS NICOMP 380 型激光散射粒径仪测定脂质体的粒经和粒径分布. 1.2.4 联动装置制备脂质体阿霉素的药物包封率测定取载药脂质体样品 0.1 mL，上
8、凝胶柱 (Sepherose, 10 mm5 cm)，以 1.9 g/L 溶液洗脱,流速 2/(mLmin). 收集洗脱液,采用异丙醇使脂质体破裂,于 480 nm 处测定 A1 值. 同样条件下测定等体积未上柱样品 A 值. 以 E(%)=A1/A100%计算包封率. 取滤液检测没有包埋进脂质体的药物量，利用未载入药物的量可以推算出载入的药量，并最终计算出药物的包封率. 1.2.5 阿霉素脂质体在体外稳定性研究分别考察不同条件下阿霉素脂质体的稳定性，其中包括温度条件，进行加速稳定性试验，溶液 pH 值，以及粒径的变化. 1.2.6 阿霉素脂质体在大鼠体内血药浓度的测定将 18 只雄性 SD
9、大鼠,随机均分为 3 组. 第 1 组股静脉注射采用联动设备制备的阿霉素脂质体，第 2 组股静脉注射配方相同非联动装置制备的阿霉素脂质体，第 3 组直接注射阿霉素溶液. 剂量均为 5 mg/kg. 于给药后0.083，0.167，0.5，1, 2, 4, 8, 12, 24，48 h 尾静脉取血 0.15 mL,同时取空白血，分离血浆,用高效液相色谱测定血药浓度. 色谱条件参考文献3. 统计学方法：采用 SPSS11.10 系统软件自动处理,结果以 xs 表示,组间差异采用单因素方差分析. 2 结果 2.1 联动装置制备阿霉素脂质体的粒径采用联动装置和非联动装置制备 3 个批次的阿霉素脂质体样
10、品，共计 6 批样品，通过形态观察其皆呈现红色乳光. 分别测定其粒径结果见表 1. 虽然联动装置制备的阿霉素脂质体与非联动装置制备的脂质体间粒径无显著性差异,但联动装置制备的脂质体粒径较小且粒径分布均匀. 表 1 脂质体阿霉素制剂的粒径 2.2 联动装置制备阿霉素脂质体包封率的测定采用联动装置和溶解分散法分别制备三批脂质体阿霉素样品，均可获得较高包封率,通过测定其对药物的包封率结果见表 2. 发现采用联动装置制备的脂质体阿霉素的包封率略高于未用设备的样品，同时批次间的差异也较小，而未采用联动装置制备的脂质体药物包封率明显下降,且批次间差异变大. 2.3 不同制备工艺制备的阿霉素脂质体在体外的泄
11、漏率测定采用联动装置和溶解分散法分别制备阿霉素脂质体样品在体外都表现了较好的稳定性，图 1 所示为 4和 40条件下，pH7.4 的磷酸盐缓冲液中两种样品中阿霉素泄漏情况. 在 4，脂质体阿霉素脂质体泄露率实质变化不大，在 40，阿霉素泄露增加 510 倍. 同时我们也观测到两种不同的制备工艺制备的阿霉素脂质体在相同介质中的药物泄漏行为存在差异. 采用联动设备制备的阿霉素脂质体在不同温度条件下，在相同的 pH 磷酸盐缓冲液中泄漏情况比一般方法制备的阿霉素脂质体制剂慢. 此结果提示阿霉素的制备工艺对其制剂的体外稳定性产生直接影响. 表 2 脂质体阿霉素制剂的包封率 2.4 不同制备工艺制备阿霉素
12、脂质体在大鼠体内的血药浓度测定静脉注射以联动装置、手动方式分别制备的阿霉素脂质体和阿霉素水溶液后,大鼠血浆中阿霉素浓度变化曲线见图 2. 可以看出水溶液剂的血药浓度随时间的变化下降很快，而到 8 h 后 HPLC 法就无法检测到其阿霉素，而两种脂质体阿霉素制剂在大鼠血液中的存在时间都超过 48 h. 对比不同制备工艺制备的阿霉素脂质体在大鼠体内血药浓度发现，非联动装置制备的阿霉素脂质体制剂在不同时间点的血药浓度为联动装置制备脂质体的 60%95%，这个结果表明：脂质体制备时的各项控制因素对于脂质体的质量非常重要. 图 2 不同阿霉素制剂在大鼠体内的血药浓度变化 3 讨论 脂质体是一种新型的递药
13、系统，其可以改善药物的体内分布、增强药物的靶向性和提高药效、降低毒副作用. 将阿霉素制备成脂质体制剂，可提高抗肿瘤活性，同时显著降低心脏毒性，并使患者脱发程度大大减小，提高生活质量 4. 虽然脂质体制剂具有十分诱人的开发前景，但是目前可用于临床的却非常有限，部分原因是由于脂质体制剂的制备工艺复杂，目前大部分制备过程是以人工手动的方式完成，因此无法很好地控制制剂的稳定性，而脂质体制剂的特性决定了其制备工艺可直接影响药物的疗效和毒性(包括粒径大小、表面电荷等)5. 为了使更多的脂质体制剂能够从实验室进入临床，我们研发了用于脂质体制备的联动装置，它采用了溶剂分散和挤压器联动的设计原理，可将我们在实验
14、室由手动完成的工艺，机械化、自动化和规范化，不但保证了脂质体制剂的批间稳定性同时提高了制剂的质量. 从实验结果可见由溶剂分散和挤压器联动装置制备的脂质体阿霉素制剂的粒径均匀且分布范围小，同时批次间的粒径大小及分布也十分近似. 通过评价该装置制备的脂质体阿霉素制剂的体内、外稳定性，发现采用该装置制备的脂质体制剂的体外稳定性优于一般手动方法制备的制剂，在 40时，联动装置制备的脂质体阿霉素制剂的泄漏率比采用手动方式制备的脂质体制剂小. 这可能是由于采用联动装置制备的制剂粒径及其分布控制较好，降低了粒径分布不均匀导致的融合现象. 通过对两种制剂在大鼠体内的血药浓度的观测我们还发现：两种脂质体阿霉素制
15、剂在大鼠血液中的时间都超过了 48 h. 而联动装置制备的阿霉素脂质体制剂的血药浓度在不同时间点均略高于非联动装置制备的制剂，对于这个结果，我们认为：对于载药脂质体这一类特殊制剂，其质量可能是影响药物体内分布及血药浓度变化的直接因素. 我们从阿霉素脂质体产业化的角度出发，利用脂质体制剂特性，考察了薄膜分散及联动装置对脂质体阿霉素制备的适用性和质量影响，期待该设备为更多的脂质体药物产业化和临床应用提供帮助. 【参考文献】 1 Gabizon AA, Liposomal drug carrier systems in cancer chemotherapy: Current status and
16、future prospectsJ. J Drug Target,2002,10:535-538. 2 陈涛,王九成,付经国,等. 脂质体药物制剂的研究现状和前景J. 世界最新医学信息文摘, 2003, 2(4):721-728. 3 Frezard F, Santaella C, Montiscin MJ, et al. Fluorinated phosphatidylcholinebased liposomes: H+/Na+ permeability,active doxorubicin encapsilation and stability, in human serunJ. Biochim Biophys Acta, 1994, 1194: 61-68. 4 郭青龙,丁启龙. 阿霉素前体脂质体与阿霉素对小鼠毒性作用比较J. 中国药科大学学报，1996，27（9）：562-566. 5 Wang RT, Chen T, Wang Z, et al. AcidSensitive polymer liposomes prepared by poly(2ethylacrylic acid) alkylamide derivativesJ. Acta Pharmacol Sin,2007,42(12):2-7.
