1、飞行时间质谱技术在乙肝及相关疾病研究中的应用【关键词】 病毒性疾病；肝炎/乙型；肝硬化；飞行时间质谱技术我国是世界上的肝炎大国，约有 1.3 亿人为乙肝病毒携带者，2 300 万慢性肝炎患者，每年死于肝炎约 23 万人，国家每年的防治经费逾 500 亿人民币。更为严重的是迄今为止尚无彻底根治乙型肝炎的治疗方案，因此慢性病毒性肝炎及其引起的肝硬化、肝癌等一系列肝病极大危害我国人民健康，而乙型肝炎又是其重中之重。乙型病毒性肝炎世界范围内流行，在已知各型肝炎中危害最严重。在我国其总的感染率为 57%，全国有 7 亿人以上感染过乙肝，同时由此而引发的肝硬化、肝癌等一系列相关疾病更是给社会带来巨大灾难。
2、例如HCC（hepatocellular carcinoma）每年大约导致 100 万人的死亡1，在世界范围内恶性肿瘤列第五位。因此，该病在我国目前乃至今后相当长一段时间内都将是防治工作的重点。1 相关背景乙型肝炎及相关疾病在临床诊治过程中，最为棘手的一个问题就是诊断不清。例如不同病理类型之间较难区分，肝硬化的分级较难判断、急性乙肝与慢性乙肝急性发作不易鉴别、肝癌的早期预警不及时等。目前临床经常采用的方法有肝脏活组织穿刺判断肝损，AFP 检测预警早期肝癌，细胞因子、胶原代谢产物等检测判断肝脏纤维化程度，此外还有各种影像学检查等。这些方法要么存在一定风险，患者依从性差，要么灵敏度和特异度低，假阳
3、性和假阴性率高，要么就是有些指标半衰期短，关联性不特异等，不能早期诊断，严重影响了临床的应用。为此，高效、灵敏和特异的诊断手段即表面增强激光解析/电离飞行时间质谱仪（surface enhanced laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF MS）技术为此提供了重要技术保障，该平台的确立为以上问题的解决提供了一个新的思路。2 SELDI-TOF MS 技术的基本原理及优势2.1 基本原理SELDI-TOF MS 又称蛋白指纹图谱技术，首次为 Hutchens 和 Yip2所描述。整套仪器包括蛋白
4、质芯片、蛋白芯片阅读器和分析软件三个组成部分。第一部分，蛋白质组研究芯片是技术核心，因其是生物芯片之一，所以同样具备高度平行性、多样化、微型化、自动化等特点。芯片表面可被修饰成化学特性或生化特性，其中被化学修饰的芯片表面的性质可以是疏水的、亲水的、阳离子的、阴离子的或磷酸化的金属亲和芯片等，因此可以有选择性的捕获特异性蛋白质。被生化修饰的芯片表面的性质可以是抗体特异性的受体结合的或酶、DNA 等，可根据抗原抗体结合供体受体结合、酶-底物、蛋白质-DNA 结合原理来分离特异性的某一种蛋白质或某一类蛋白质。第二部分，芯片上特异性结合的蛋白分子被激光脉冲轰击，不同质荷比的离子在电场中飞行的时间长短不
5、一，分子量越大的离子在电场中飞行的时间越长，反之则越短。这些飞行时间长短不一的离子被接受器获取后阅读可绘制出一张质谱图。第三部分即相关分析软件的处理，包括峰检测、数据分析、标志物选取、标志物的评估、组合模式的建立等，同时可以形成模拟谱图，来更加直观的显示样品中各种蛋白质的相对分子质量、含量、等电点、糖基化位点、磷酸化位点等信息。2.2 技术优势由于 SELDI-TOF MS 是在总结前人成果、新近发展的检测技术，因此相比之下有很多优势，比如：不会破坏蛋白质结构；样品不需要特殊前处理，可以直接使用血清、尿液、组织抽取物等；在使用中由于一部分非特异结合的分析物被洗脱，因而出现的蛋白质峰非常一致，有
6、利于后期分析；节省时间，出结果快速；对于低丰度的物质，只要与表面探针结合，便可检测；大规模、超微量、高通量、全自动筛选；可以分析二维电泳所无法分析的蛋白质，包括疏水性蛋白、碱性或酸性过高的蛋白、小分子量的蛋白等。此外还有更为重要的优势在于同传统方法相比，该技术不仅可以发现待测样品中一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，而传统方法往往只检测一种标志物，其灵敏度和特异度均不够理想。由于在疾病的不同病理阶段，其蛋白质的表达必定不同，尤其是与肿瘤相关的低丰度蛋白，这些表达的蛋白质谱图极可能与疾病的发生发展有关，因此通过该技术所检测出蛋白质谱就有可能成为一种新的诊断模式3
7、。SELDI-TOF MS 技术是以整个蛋白质组为检测对象，是一种显示疾病过程中多种蛋白质变化的复合图像的模式诊断方法，对某些特殊疾病如癌症在相关蛋白质的识别上已取得了一系列突破性进展4。由于疾病的发生发展其生理表现是全方位的，因此寻找特定疾病的单一生物学标志物难度极大，同时意义有限。故理论上讲，只有多个生物标记的结合运用才能有效检测和诊断疾病，这就产生了蛋白质组谱图诊断方法（proteomic pattern diagnostics） ，一种全新的诊断模式5-7。该方法实际上就是利用差异蛋白质组学，通过比较分析不同病理类型血清样本的蛋白质表达差异，对差异表达蛋白进行鉴定、定量等，筛选出生物标
8、记，结合生物信息学分析，建立起新的疾病诊断模式即蛋白质指纹图谱，目前该种研究已经在世界范围内形成了热潮。Emanuel8等通过研究认为，微生态环境中蛋白质表达的变化，即特征蛋白质谱图可以为早期的癌症预警，这种可能性是存在的。另外针对肝癌的早期检测，EL Aneed9也撰文指出，目前常用的生物标记AFP 的灵敏度并不高，用其作为肝癌的早期诊断有一定的不确定性，因此利用 SELDI-TOF 技术检测血清中蛋白质表达以期发现差异蛋白作为生物标记不失为一个好的想法，经过不断的改进和成熟后，完全可以成为旧的诊断模式的替代品。2.3 在肝病中的研究进展SELDI-TOF 技术的应用研究已在多个领域展开，而
9、且成绩显著10。本文集中介绍该技术在乙型肝炎及相关疾病的研究应用。Schwegler 等11对 170 例美国人血清的队列研究后认为，SELDI血清蛋白质谱图能够将 HCC 与肝硬化甚至硬化前期很好地区分开。Poon12等采用 SELDI-TOF MS 技术对慢性乙型肝炎患者的血清进行了蛋白质指纹分析，慢性乙型肝炎患者肝纤维化程度用肝穿刺来确定。研究结果表明，有 30 个蛋白质峰与肝纤维化程度密切相关，根据这些峰建立的人工神经网络（SNN）诊断模型，能够有效地预测慢性乙型肝炎患者的肝纤维化程度。Zhu 等13应用蛋白质芯片技术，利用 25 例乙肝纤维化病人和 20例丙肝患者及 25 例严格年龄
10、配对的健康对照者，发现质荷比 7 772 和 3 933 蛋白质峰对照显著高于乙肝纤维化患者，该诊断模式具有 80%的灵敏度，81.8%的特异度，75%的阳性预测值。结论该模式可用于诊断并进行疾病进展之评估。张其胜等14动物实验表明，通过比较早、中、晚期大鼠肝纤维化的血浆蛋白质组学，找到了 6 个蛋白质或多肽组成的模式，根据它可以将早、中、晚期的肝纤维化的大鼠 100%分开，结果令人鼓舞。Wang15等运用 SELDI 技术结合人工神经网络方法，分析肝癌、肝硬化患者和正常人血清样本中的蛋白质表达谱图，发现肝癌组和肝硬化组、肝癌组和正常组各有 2 个蛋白质峰存在显著差异，据此可以将 AFP诊断的
11、假阳性和假阴性检出。龙云铸16曾用此方法来诊断 HCC，与 AFP 相比，其灵敏度和特异度均达到 100%，其结论为蛋白质谱图有望成为高危人群中和普通人群中恶性肿瘤筛检有力工具。Poon17等采用 IMAC3、WCX2 芯片和 SELDI-TOF-MS 技术研究了 20例慢性肝病（CLD）和 38 例原发性肝癌（HCC）患者的血清，结果在 HCC组中发现了 88 个蛋白质峰明显高于 CLD 组，162 个蛋白质峰明显低于CLD 组，对蛋白质表达谱图结合人工智能分析和交叉验证，灵敏度和特异度均超过 90%，据此可以判断，特征的蛋白质表达图谱有利于肝癌的诊断。张建中7等利用 SELDI 技术发现肝
12、癌患者和正常人的血清蛋白质谱图之间有 17 个稳定的标志蛋白质，其中 6 个在肝癌患者血清中高表达，11 个则低表达，分析系统据此建立起一个肝癌的诊断模型，其对肝癌的诊断特异性为 97.06%，灵敏度为 91.18%，阳性预测值高达 96.88%，结果充分证明了该方法对肝癌诊断的重要价值。国内宋森涛等18等也利用SELDI-TOF 技术发现了一种新的分子量在 11 492.927.05Da 的肝癌相关蛋白质，对肝癌的早期诊断具有一定的价值。以上研究结果均有力地证明，飞行时间质谱技术在乙型肝炎及相关疾病的研究中具有令人鼓舞的前景。3 问题与挑战众多的研究成果并不能掩盖该技术本身所存在的问题。对于
13、 SELDI技术而言，检测的仅仅是蛋白质荷比，每个 m/z 值对应的可能是很多分子量相近的多肽，我们只能知道蛋白质的分子量和丰度19，不能对样本中的蛋白质进行鉴定20，21，包括蛋白质的结构、功能、是否是已知蛋白等均不清楚。因此需要进一步通过质谱技术，分析该蛋白的多肽片断得到其肽指纹图，在蛋白质数据库中查询与之匹配的蛋白质。检验结果的可重复性和外部真实性是本技术推广的另一个障碍。尤其是后者。结果证明，尽管在不同试验室都可检测到相同的蛋白质峰，但并不是总表现出相同的人群表达差异22。此外，SELDI 目前未能全面开展的另一个重要原因是缺乏标准的统一的软件，这需要确立标准检测条件以及大量的患者和健
14、康人的样本资料分析系统，制作统一标准的软件。对于所发现的新的生物标记物在用于临床前必须经过严格的多中心协作研究和三期临床研究验证，以最大的可能排除实验技术因素造成的误差，提高诊断的灵敏度和特异度。同时鉴定费用高、技术支持和经验不足、临床接受尚需时间，蛋白质芯片制备等问题也是不可忽视的。4 前景展望SELDI-TOF 技术应用几年来，成绩显著，尤其在肝脏病领域的应用已经得到证实。由于该技术可以提供大量、完善、动态的蛋白质指纹图谱，并能检测治疗前和治疗后以及治疗过程中的蛋白质的变化，这将对未来的诊断学和治疗学的理论和应用，进一步完善疾病的自然史将产生深远的影响23。尽管目前看来，传统的对单个蛋白质
15、进行分析鉴定的技术尚不能在短期内被取代，但随着技术的进步和完善，一旦标准检测条件确立，资料库建立并成熟，将会对本领域的研究产生不可估量的影响。【参考文献】1 Ferlay J，Bray F，Pisani P，et al.GLOBOCAN 2000： Cancer Incidence，Mortality and Prevalence WorldwideM.IARC Scientific Publications，IARC Press，Lyon，2001.2332 Htchens TW， Yip TT.New desorption strategies for the mass spectrome
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