1、广州市登革 1 型病毒基因组测序及系统进化分析作者：文金生，江丽芳，晏辉钧 【摘要】 目的 ：对引起 2002 年广州登革热的登革 1 型病毒分离株（71/02GZ）进行全基因组测序和系统进化分析。方法：采用 C6/36 细胞培养 71/02GZ，分别采用 RT-PCR，5RACE 和 3RACE 扩增基因组中编码区序列、5和 3末端非编码区序列，PCR 产物克隆到载体并测序，拼接成全基因组序列，分别基于 E 基因序列、E/NS1 连接区 240 nt、基因组中 10 016 nt 进行系统进化分析。结果：71/02GZ 株基因组全长 10 735 nt，两端非编码区（NCR）长度分别为 94
2、 nt 和 462 nt。基于 E 基因序列、E/NS1 连接区 240 nt、基因组中 10 016 nt 的进化分析结果显示71/02GZ 株和 2002 年广州分离株（GZ01/02，GZ/218/2002） ，1995 年广东分离株（GD23/95，GD01/95） 、1995 年广州分离株（GZ01/95）组成一个基因型；而 1999 年广东分离株（GD05/99） ，1997 年广东分离株（GD14/97）和 1980 年广州分离株（GZ/80）属于另一个基因型；另外，71/02GZ 株同 1998 年印度尼西亚分离株（98901530 DF DV-1-ID）的同源性最高。结论：7
3、1/02GZ 株可能是印度尼西亚输入的。 【关键词】 登革病毒；测序；系统进化分析Abstract: Objective: To perform complete genome sequencing and phylogenetic analysis of a DENV-1 isolated (71/02GZ) strain which caused dengue fever in Guangzhou during 2002. Methods: Progagate 71/02GZ in C6/36 cells， the different fragments in viral genome i
4、ncluding 5 terminal and 3 terminal were amplified using RT-PCR，5RACE and 3RACE ；PCR product was cloned to vector and then sequenced；Based on E gene nucleotide sequence、E/NS1 junction region 240 nt，10 016 nt of the genome， the phylogenetic relationship of 71/02GZ isolates and other DENV-1 isolates we
5、re analyzed， respectively. Results: The complete genome of 71/02GZ was 10 735 nt，the 5terminal and 3terminal NCRs were 94 nt and 462 nt， respectively. Phylogenetic analysis， based on E gene sequence， E/NS1 junction region 240 nt， 10 016 nt of the genome， showed that GD05/99 strain， GD14/97 strain an
6、d GZ/80 strain belonged to one genotype ；71/02GZ strain， GZ01/02 strain， GZ/218/2002 strain， GD23/95 strain，GD01/95 strain and GZ01/95 were the members of another genotype. In addition，71/02GZ strain was closely related with 98901530 DF DV-1-ID strain isolated in Indonesia in 1998. Conclusion: Strai
7、n of 71/02GZ may be imported from Indonesia.Key words: Dengue virus；sequencing；phylogenetic analysis登革病毒（Dengue virus，DENV）为单股正链 RNA 病毒，包括 4个血清型（DENV-1，2，3，4） ，其基因组全长约为 11 kb1。DENV 感染可以引起轻度的登革热（Dengue fever，DF）和严重的登革出血热（Dengue hemorrhagic fever，DHF）/登革休克综合征（Dengue shock syndrome，DSS） 。2002 年 DENV-1
8、在广州市区引起 1 423 例患者发病2-4。与以往相比，此次大流行具有典型的特点：流行持续时间长，各年龄组都有发病患者；疫情来势凶猛，爆发点多，涉及面广；本次流行是历史上在广州市区内发生的规模最大的一次。因此，阐明此次流行登革病毒株的可能来源对于登革的预防、控制以及疫苗的研发具有重要的指导意义。本研究拟采用 RT-PCR，5RACE 和 3RACE 等技术对本次流行时分离的一株 DENV-1（71/02GZ） 进行全序列测定，并基于全基因组序列、E 基因序列和 E/NS1 连接区 240 nt，使用 Mega 4.0 软件进行系统进化分析。1 材料和方法1.1 病毒株 71/02GZ 株于
9、2002 年自广州 1 例 DF 患者血清中分离（采用 C6/36 细胞） ，型特异性 RT-PCR 检测证实其为 DENV-1。71/02GZ 株冻存于液氮中。1.2 引物设计与合成参考 DENV-1 的 Singapore S275/90 株(GenBank Accession Number：M87512)和 1998 年印度尼西亚分离株(GenBank Accession Number：AB189121)，利用 Primer premier 5 设计扩增编码区的 13 对引物，5非编码区（NCR）下游引物，3NCR 上游引物，引物由Invitrogen 公司合成，引物见表 1。1.3 病
10、毒 RNA 的提取及逆转录 将 71/02GZ 接种到长成单层的 C6/36 细胞，23 d 后，当细胞病变（CPE）出现（+）时，收集细胞及培养液用于提取 RNA。0.2 mL 病毒液加入 1 mL Trizol，混匀，室温 10 min。加入氯仿 0.2 mL，振动 15 s，室温 10 min。 4 12 000 次/min，离心 15 min。 吸取上清，加入异丙醇 0.5 mL，室温 10 min。4 12 000 g/min，离心 15 min。去上清，加入冷冻的 75%乙醇 1 mL 洗涤 1 次。4 7 500 g/min，离心 10 min。去上悬液，空气干燥。用 DEPC
11、处理水溶解 RNA 沉淀。总 RNA 5LDEPC 处理水 34L下游引物（25mol/L）2L。65 55 min。加入 10Buffer 5L，10 mmol/L dNTP 2L，RNA 酶抑制剂1L，逆转录酶 1L。42 1 h，90 5 min。1.4 编码区的扩增、克隆和测序 50L（EX Taq 酶 0.25L，10Buffer 5L，cDNA 5L，20 mmol/L 上游引物 1L，20 mmol/L 下游引物 1L，DEPC 处理水 37.75L） ，94 3 min，35 个循环（94 50 s，退火温度 1 min，72 1 min） ，72 7 min。PCR 产物琼脂
12、糖凝胶电泳，将含有目的条带的凝胶切下，采用 PCR 产物回收试剂盒回收。 PCR 回收产物克隆入 pMD18-T 载体，转化 DH5 感受态细菌，提取质粒 PCR 鉴定以及酶切鉴定成功后送英韦创津公司测序。1.5 5RACE 和 3RACE 及测序5RACE 和 3RACE 试剂盒购自 Invitrogen 公司，参照说明书进行。简而言之，分别采用 5RACE 下游引物和 3RACE 上游引物结合试剂盒扩增、纯化。回收纯化的 PCR 产物连接进 pMD18-T 载体，转化 DH5 感受态菌，鉴定成功后测序。 1.6 系统进化分析 用 DNAStar 软件对测定序列进行编辑与拼接。分别基于 E
13、基因序列、E/NS1 连接区 240 nt 和基因组中 10 016 nt 采用 Mega 4.0 软件对71/02GZ 进行系统进化分析，病毒株核苷酸序列差异小于 6%定义为 1 个基因型。1.6.1 基于 E 基因序列进化分析：选取 2002 年及之前东南亚、广东省内分离的 DENV-1 株，其他国家 1980、1993、1995、1997、1999和 2002 年分离的 DENV-1 病毒株。基于 E 基因序列进化分析。1.6.2 基于 E/NS1 连接区 240 nt 进化分析：选取 2002 年及之前东南亚、广东省内分离的 DENV-1 株，选取其他国家 1995、1997、1999
14、和 2002 年分离的病毒株以及世界上较早分离的 DENV-1 病毒株。基于E/NS1 连接区 240 nt 进化分析。1.6.3 基于基因组中 10 016 nt 进化分析：选取 2002 年及之前世界上几乎所有测全序的 DENV-1 病毒株。基于基因组中 10 016 nt（从15-10028）进化分析。2 结果2.1 测序和基因组特征 通过 RT-PCR，5RACE 和 3RACE 法获得覆盖 71/02GZ 株基因组全长的 15 个片段。将 15 条 PCR 片段插入 T 载体制成重组质粒。筛选阳性重组质粒并采用 ABI 公司 3770 测序仪对重组质粒分别进行测序。将测序结果拼接成全
15、序列，提交到 GenBank 数据库，登录号为：EF025110。71/02GZ 株基因组全长 10735 核苷酸（nt） ，不含 poly(A)尾。含有一个开放读码框，编码 3393 个氨基酸。两端各有一个 NCR，长度分别为 94 nt 和 462 nt。2.2 系统进化分析 2.2.1 基于 E 基因序列的进化分析：89 株 DENV-1 形成 4 个基因型。基因型包括 1999 年广东分离株（GD05/99） ，1997 年泰国、广东分离株（GD14/97） ，1995 年泰国分离株，1993 年泰国分离株，1980 年广州（GZ/80） 、泰国分离株，1943 年日本分离株组成；基因
16、型包括 2002 年广州分离株（GZ01/02，GZ/218/2002） ，71/02GZ 株和 1995 年广东分离株（GD23/95，GD01/95） 、广州分离株（GZ01/95） （见图 1） 。2.2.2 基于 E/NS1 连接区 240 nt 的进化分析：74 株 DENV-1 分为6 个基因型。基因型 I 包括 1999 年中国广东株（GD05/99） ，1980 年中国广州株（GZ/80） ；基因型 II 包括 71/02GZ 株，1995 年中国广东株（GD23/95，GD01/95） 、广州株（GZ01/95） （见图 2） 。2.2.3 基于基因组中 10016 nt 的
17、进化分析：51 株 DENV-1 形为 3个基因型。基因型包括 1999 年中国广东株（GD05/99） ，1997 年中国广东株（GD14/97） ，1980 年中国广州株（GZ/80） ；基因型包括 71/02GZ株，1995 年中国广东株（GD23/95，GD01/95） 、广州株（GZ01/95） （见图3） 。3 讨论 对 DENV 进行系统进化分析研究可为阐明 DENV 起源、致病机制、疫苗的研制提供线索。系统进化树的构建，首先必须选择目的基因片段，在 DENV 的研究中常用的有 E 基因序列、E/NS1 连接区 240 nt（因为它们在 DENV 中具高度的保守性，其变异更能反映
18、 DENV 的进化进程） 。当然使用全基因组序列进行系统进化分析更能全面地反映 DENV 的进化，但是由于全序列测定工作量较大，限制了其作为靶基因序列的广泛应用。其次选择系统进化树构建方法，目前构建方法及其计算机分析软件种类越来越多，但是主要有三类：简约法、距离法和似然法5。距离法使用比较广泛。对于同一型 DENV，为了便于把不同地理区域分离株分离开来，研究者们引入了基因型的概念，国外研究者多以核苷酸差异大于 6%作为DENV 基因型的分型标准，其基本上能把不同地理区域的分离株分开6。 DENV 在广东地区有 30 年的断续流行史。但是对于 DENV 的起源，目前还没有定论。早期人们认为 DE
19、NV 可能是输入性的，曾有研究者认为广州市的 DENV-1 可能来源于菲律宾、印度尼西亚和泰国等东南亚和西太平洋国家7。但是，目前广州地区存在有利于 DENV 流行的自然因素和社会因素，且连续数年流行一种型别 DENV8，因此有必要探讨 DENV 在广州是否已经本地化。2002 年度，广州地区发生了 DF 的大规模流行（DENV-1） ，本次流行范围广，危害大。因此对本次流行时分离 DENV-1 株进行测序和系统进化分析，可以为探讨本次 DENV-1 的可能来源以及为确定能代表广东地区的 DENV 的参考株提供信息。在本研究中，我们对 71/02GZ 株测定了全序列，分别基于 E 基因序列、E
20、/NS1 连接区 240 nt 序列和基因组中 10014 nt 分析 71/02GZ 株同其他 DENV-1 株的进化关系。结果显示：对于广东地区分离的 DENV-1 株，三种系统进化分析结果基本一致。GZ/80 株（1980年分离） 、GD14/97 株（1997 年分离）和 GD15/99 株（1999 年分离）位于同一个基因型内；而 71/02GZ 株（2002 年分离） 、GZ01/02 株（2002 年分离） 、GZ/218/2002 株（2002 年分离） 、GD23/95 株（1995 年分离） 、GD01/95 株（1995 年分离） 、GZ01/95 株（1995 年分离）
21、及部分东南亚国家分离株(A88，02SA079，02SA073， 02SA029， 02SA047， 02-13-1HuNIID， 95SLMC28， 99SA236， 99SA660， 02SA071， 02RBD008， AUS HAT17，ET243，98901530 DF DV-1，02-17-1HuNIID， D1/Hu/Indonessia/NIID09/2002， 02-07-1HuNIID)位于另一个基因型内。由此可见，广州地区二十多年来 DENV-1 分离株明显分为两个进化群，也可以说分为两个来源。但是，71/02GZ 株在所处的基因型中与 98901530 DF DV-1（
22、1998 年印度尼西亚分离株）的同源性最近，属于其下的一个分支。据此，我们推测 71/02GZ 株应该不是由广东本地分离株进化的结果而倾向于输入性的。当然，还需要测定大量的登革病毒全基因组序列以及进化分析来证实我们的猜想。【参考文献】1C.M. Rice In: B.N. Fields, D.M. Knipe and P.M. Howley,Editors, Flaviviridae: the viruses and their replication. Field 抯 Virology (3rd ed.), Lippincott-Raven, Philadelphia,1996:931-95
23、9.2陈燕清, 张复春, 王建, 等. 2004 年广州首例输入性登革热的临床分析J. 热带医学杂志, 2005, 5(2):142-143.3何丽娟, 吴新伟, 狄飚, 等. 2000-2004 年广州市登革热血清学和病原学分析J. 预防医学情报杂志, 2006, 22(2): 150-152. 4潘志明, 邱季春, 陈小霜, 等. 九十年代中期广州市登革热流行情况分析J. 广东卫生防疫, 2000, 26(1): 33-35. 5Morrison DA. Phylogenetic tree-buildingJ. Int J Parasitol,1996,26(6):589-617. 6Ky
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