1、谷子籽粒小米黄色素含量的测定 1杨延兵 1 张 涵 1 王润丰 1 邓立刚 2秦 岭 1 陈二影 1 管延安 1（山东省农业科学院作物研究所 1，济南 250100（山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 2，济南 250100）摘 要 小米黄色素含量的定量测定不仅有助于小米产品质量评判的标准化，促进小米产品的精深加工，而且对于谷子品质育种也具有重要意义。本研究参考美国谷物化学师协会（AACC）14-50 方法，研究了不同提取溶剂、提取方式、提取时间等因素对小米黄色素含量的影响，优化完善了小米黄色素含量的测定。测定谷子籽粒小米黄色素含量，以 -胡萝卜素制作标准曲线，利用水饱和正丁醇振荡提
2、取 3 h，10000 g 离心 8 min 取上清，在 445 nm 下定量测定小米黄色素含量； -胡萝卜素吸光度和质量浓度在 05.0 g/mL 范围内关系良好，相关系数 r=0.9999。该方法测定小米黄色素，相对标准偏差3%，加标回收率92.77%103.18%，灵敏准确、简便快速，精密度较高，适用于小米黄色素的测定。关键词 谷子 黄色素含量 测定方法中图分类号：S515 文献标识码：A 文章编号：1003-0174（ ）Determination Method of Yellow Pigment Content in Foxtail Millet（Setaria italica (L
3、.) P. Beauv）Yang Yanbing1 Zhang Han1 Wang Runfeng1 Deng Ligang2 Qin Ling1 Chen Erying1 Guan Yanan1(Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences1, Jinan 250100)（Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products, Shandong Academy of Agricultural Sciences2, Ji
4、nan 250100）Abstract Quantitative determination of yellow pigment contents in foxtail millet grains in a precise manner is favorable to standardize evaluation of foxtail millet product quality, promoting further process of foxtail millet products. Moreover, it is of great significance for quality bre
5、eding for foxtail millet. The present research dealt 基金项目：山东省现代农业产业技术体系创新团队专项资金（SDAIT-15-03） ，山东种业集团股份有限公司创新项目（2016-2018） ，山东省自然科学基金（ ZR2014YL021） ，现代农业产业技术体系专项（CARS-06）收稿日期: 2018-06-04作者简介：杨延兵，男，1971 年出生，研究员，谷子杂粮研究with the improvement of the AACC method 14-50 for the determination of yellow pigment
6、 contents in foxtail millet grains through optimizing extraction solvents, methods, duration times as well as other factors. In the improved method, -carotene was used to make a standard curve; the yellow pigment in foxtail millet grains was vibrating extracted in water saturated n-butyl alcohol for
7、 3 h; then supernatant was retained after centrifugation at 10,000 x g for 8 min; finally, yellow pigment content was determined at 445 nm. The absorbency and contents (0 5.0 g/mL) of -carotene showed an excellent linear correlation (r2 = 0.9999). With this method, the yellow pigment content was acc
8、urately determined with the relative standard deviation 3 % and the adding standard recovery rate ranging from 92.77 % to 103.18 %. The result demonstrated that the improved method was highly sensitive, simple and accurate for rapid quantitative determination of yellow pigment content in foxtail mil
9、let grains.Key words foxtail millet, yellow pigment content, determination method谷子（Setaria italica （L.） P. Beauv.）又称为粟，去壳后称为小米，在植物学上属禾本科狗尾草属。它起源于中国，栽培历史悠久，据考古学研究，距今约有 10000 多年的栽培历史 1-2，曾长期是我国北方的主要粮食作物。它抗旱耐瘠、水分利用效率高、适应性广，至今在干旱和半干旱地区仍是重要的粮食作物。小米营养丰富且各种成分平衡，其品质在营养保健中的作用独特，加强研究、发掘利用这一作物的营养保健价值，对于促进农业供给
10、侧结构性改革，丰富提高人们日益增长的物质生活需求有重要意义。多数谷子品种的小米为黄色，黄色的主要来源为黄色素。小米黄色素主要组分为天然类胡萝卜素，主要含有叶黄素、玉米黄质以及少量的隐黄质、-胡萝卜素等 3-5，这些类胡萝类素不仅具有保护视觉与上皮细胞的作用，而且可以提高人体免疫力，淬灭体内过多自由基，预防多种癌症，同时对口腔溃疡、皮肤病等都有很好的疗效。不同谷子品种的小米黄色素及主要组分类胡萝卜素含量存在差异，研究培育类胡萝卜含量高，色泽金黄，外观品质好的谷子新品种是谷子遗传育种的重要目标之一，因此定量测定谷子品种小米黄色素含量对于选育高类胡萝卜素含量的品种有重要的意义。同时，定量测定小米黄色
11、素含量有助于小米产品质量评判的标准化，促进小米产品的精深加工。小米黄色素具有一定的耐热性、耐还原性和耐氧化性,对光和酸性条件稳定性较差，不溶于水，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有机溶剂,其乙醇提取物最大吸收波长为445 nm 或 446nm6-8；利用超声波辅助提取可以明显增加小米黄色素产量 9-10。这些研究主要侧重于对小米黄色素化学性质及其提高小米黄色素得率，研究探讨利用提取的小米黄色素作为色素添加剂应用食品工业等方面。而关于小米黄色素的定量测定研究则较少，杨延兵等参考美国谷物化学师协会 AACC 14-5011测定小麦粉黄色素的方法研究了我国谷子品种小米黄色素含量的差异及小米黄色素与
12、外观品质的关系,研究表明小米黄色素含量的高低不仅和小米的营养价值有关，而且也是反应小米外观品质的重要指标 12-13。然而，小米黄色素组成和小麦粉黄色素组成可能存在一定的差异，因此，优化完善谷子品种中小米黄色素的测定，比较准确的测定小米黄色素含量，尽可能减少误差，具有重要的意义。本研究从不同溶剂、提取时间、提取方式以及回收率等方面对小米黄色素的测定进行了研究，以期为小米黄色素的定量测定以及谷子品质育种提供依据。1 材料与方法1.1 实验材料谷子品种：济谷 12、济谷 16、济谷 17、济谷 19、豫谷 18。 标准品及试剂：叶黄素、玉米黄素、-胡萝卜素标样： Chromadex 公司，-隐黄质
13、：Sigma 公司（美国） ，三氯甲烷、无水乙醇、正丁醇等试剂：国药集团。1.2 仪器设备粉碎机：德国 RETSCH（莱驰）公司；台式多用离心机-冷冻型：美国 SORVALL（索福）公司；UV2600 紫外/可见光分光光度计：日本 SHIMADZU（岛津）公司。1.3 方法1.3.1 不同溶剂提取小米黄色素：无水乙醇、水饱和正丁醇。1.3.2 不同提取方式提取小米黄色素的含量：无水乙醇、水饱和正丁醇两种提取液震荡提取（1、2、3 h）和振荡提取（1、2、3 h）+超声波提取 20 min。1.3.3 利用水饱和正丁醇提取不同时间的小米黄色素含量：1、3、5、7、24 h。1.3.4 建立标准曲
14、线制作标准 -胡萝卜素曲线。称取 5.0 mg -胡萝卜素，用三氯甲烷溶解，然后再溶于 50 mL 水饱和正丁醇溶液中，测定 -胡萝卜素标准液浓度（ -胡萝卜素在 450 nm 吸光系数=259214） 。分别吸取 0、100、200、300、400、500 L -胡萝卜素溶液稀释至 10 1%1mL，测定吸光度，3 次重复，建立标准曲线。1.3.5 样品处理测定用砻谷机把谷子籽粒脱壳，把小米超离心粉碎。称取 1.00 g 样品放入约 30 mL 具塞的离心管内，加入 10.0 mL 水饱和正丁醇，盖紧塞子，混旋器上混合，使样品充分湿润。把离心管放在往复振荡机上避光振荡提取一定时间，然后静置
15、10 min。10 000g 离心 8 min至上清液清亮，以水饱和正丁醇空白作对照，吸收波长 445 nm 处测定提取液吸光度，计算黄色素含量。小米黄色素含量=A， 为根据标准曲线得到的系数，A 为提取液吸光度。2 结果与分析2.1 提取溶剂对小米黄色素的影响利用无水乙醇和水饱和正丁醇提取不同谷子品种小米黄色素，进行光谱扫描，记录最大峰值。无水乙醇和水饱和正丁醇提取同一品种小米黄色素扫描光谱有一定差异（图 1 济谷 19 小米两种提取液扫描光谱） 。两种溶剂提取的小米黄色素最大吸收峰值也略有差异（表 1） ，不同品种无水乙醇提取液最大波峰值平均为 445.8 nm，水饱和正丁醇提取液最大波峰
16、值平均为 447.5 nm。说明两种提取液提取的小米黄色素在质和量上有一定差异。同一提取液不同品种之间最大吸收波长也略有差异，这说明不同品种之间在黄色素的组分上存在差异。图 1 不同提取溶剂提取济谷 19 小米黄色素吸收光谱图表 1 不同提取溶剂对小米黄色素提取液最大峰值的影响 品种 无水乙醇提取液/nm 水饱和正丁醇提取液/nm济谷 12 446.0 447.6济谷 16 446.0 447.4济谷 17 445.4 447.4济谷 19 446.0 447.6豫谷 18 445.4 447.3平均 445.8 447.52.2 小米黄色素与主要组分标准物质光谱比较对小米黄色素提取物及叶黄素
17、、玉米黄质、-隐黄质、-胡萝卜素等标准物质在 350-550 nm 范围内进行光谱扫描（图 2） 。不同类胡萝卜素之间光谱特征有一定差异，小米黄色素的光谱特征和叶黄素光谱特征最接近。叶黄素最大峰值 445 nm，玉米黄质最大峰值 452 nm，- 隐黄质最大峰值 451 nm，-胡萝卜素最大峰值 450 nm，小米黄色素最大峰值 447.5 nm。图 2 小米黄色素及部分类胡萝卜标准物质光谱图2.3 提取溶剂对小米黄色素含量提取效率的影响分别利用水饱和正丁醇和无水乙醇往复震荡提取 3 h 进行提取完全度实验，测定 5 个谷子品种小米黄色素含量，结果如表 2。每个品种无水乙醇提取液小米黄色素测定
18、值都低于水饱和正丁醇提取小米黄色素测定值，乙醇提取小米黄色素测定值只有水饱和正丁醇提取测定值的 66.93 %73.76 %，平均为 69.78 %，利用水饱和正丁醇提取的小米黄色素较完全。表 2 不同提取溶剂对小米黄色素含量的影响品种 水饱和正丁醇/mg/kg 无水乙醇/mg/kg 无水乙醇/水饱和正丁醇/%济谷 12 21.440.13 15.460.10 72.11济谷 16 16.980.36 11.360.09 66.93济谷 17 10.220.11 6.830.14 66.79济谷 19 24.270.20 17.900.09 73.76豫谷 18 24.050.11 16.66
19、0.07 69.30均值 19.39 13.64 69.782.4 提取方式对小米黄色素含量的影响以济谷 16 小米样品为试材，分别利用水饱和正丁醇和无水乙醇采用震荡提取和振荡提取+ 超声波 20 min 两种方式，提取不同时间（分别 1、3、5 h） ，测定小米黄色素含量，结果如表 3。同一提取时间，水饱和正丁醇提取黄色素含量显著大于乙醇提取黄色素含量。两种溶剂同一时间，振荡提取后，再用超声波提取 20 min，黄色素含量平均值明显增大，但是标准偏差也相应增大，测定黄色素含量的稳定性变差。表 3 不同提取方式小米黄色素含量的影响2.5 提取时间对小米黄色素含量的影响利用水饱和正丁醇提取小米黄
20、色素 1、2、3、5、7、24 h，测定结果如表 4。提取 1 h黄色素含量略低，37 h 小米黄色素含量基本维持在平台期，黄色素含量的变化很小。因此，小米黄色素振荡提取 3 h 后测定，在 24 h 时间内测定完毕，小米黄色素含量变化相对较小。振荡提取 24 h 后小米黄色素含量有略微下降，这可能与提取时间过长，部分小米黄色素降解所致。所以测定小米黄色素含量以振荡提取 3h，开始测定为宜。表 4 提取时间对小米黄色素含量的影响品种 1 h /mg/kg 3 h /mg/kg 5 h /mg/kg 7 h /mg/kg 24 h /mg/kg济谷 12 21.770.16 22.070.09
21、22.230.10 22.350.09 22.190.04济谷 16 16.190.07 17.130.31 17.310.02 17.440.15 16.990.04济谷 17 10.190.06 10.310.09 10.390.07 10.430.10 10.230.05济谷 19 24.100.10 24.450.12 24.550.16 24.800.15 24.410.06豫谷 18 23.480.31 24.360.11 24.650.29 24.440.13 23.710.142.6 标准曲线的建立绘制的 -胡萝卜素标准曲线如图 3，线性范围 0-5.0 g/mL，标准曲线回归
22、方程：小米黄色素含量=54.7A，相关系数 r=0.9999。振荡提取/mg/kg 震荡提取+超声波 20 min /mg/kg提取溶剂1h 3h 5h 1h 3h 5h无水乙醇 9.590.09 11.570.11 13.40.22 15.141.67 15.891.84 17.632.38水饱和正丁醇 17.050.12 17.160.07 17.410.28 18.251.10 20.532.18 19.621.75图 3 标准曲线2.7 不同谷子品种黄色素样品测定与回收率分析精确称取 1.0 g 不同谷子品种小米样品，每个样品重复 5 次，按照 1.3.5 制备的样品溶液，振荡提取 3
23、 h，测定小米黄色素含量，计算相对标准偏差（RSD） 。同时，每个样品再称取 5 份，添加 -胡萝卜素标准溶液，计算加标回收率，结果如表 5。结果 5 个谷子品种相对标准偏差（RSD）1.16%2.14%，都小于 3%，表明该方法准确可靠，精密度较高。各样品加标回收率为 92.77%103.18%，表明该方法测定结果准确。表 5 样品测定结果及加标回收率测定结果（n=5）品种 本底值/mg/kg RSD /% 加标量/mg/kg 加标测定值/mg/kg 回收率/%济谷 12 21.37 1.26 22.0 41.78 92.77济谷 16 16.32 1.16 22.0 38.17 99.32
24、济谷 17 10.27 2.14 11.0 21.62 103.18济谷 19 24.38 1.44 22.0 45.58 96.36豫谷 18 24.25 1.94 22.0 46.72 102.143 讨论本研究分别利用无水乙醇和水饱和正丁醇提取小米黄色素，利用水饱和正丁醇提取小米黄色素较完全，得率较高。利用水饱和正丁醇提取小米黄色素，经过高速离心后一般提取上清液透明，测定值较稳定，比较适于对小米黄色素含量做定量测定。但正丁醇会易散发出令人难闻的气味，测定最好在通风橱内完成。用无水乙醇提取，小米黄色素得率低于水饱和正丁醇提取；而且离心后，部分品种提取液易出现一定的浑浊，测定值不太稳定，不太
25、适用于大量样品谷子黄色素的定量测定；但由于无水酒精提取液酒精易挥发，酒精挥发后得到黄色素固体粉末，且酒精无毒，适于食用色素的提取。Comment U1: 参考文献格式请按照修改意见01文档进行修改；并请补充中文参考文献对应的英文翻译，不需单独编号，原先的中文参考文献仍然需要保留。有关研究表明，利用超声波提取，可以提高小黄色素产量 9-10，本研究表明超声波的确能增加黄色素产量。但是，在试验过程中，超声波提取后试验数据稳定性变差，有的提取液中有细微小颗粒，疑似提取液浑浊。造成这种现象的原因可能是超声提取状态下，产生细微的固体或液体颗粒，而这种小颗粒难以通过加大离心转速解决，造成试验结果误差较大；
26、因此定量测定小米黄色素，提取过程不宜使用超声波处理，直接振荡提取就可。本实验研究了不同提取时间、提取方式对小米黄色素含量的影响，提取时期短提取不充分，研究条件下认为振荡提取 3 h是比较适宜的时间； 3-5 h时间内避光振荡提取对小米黄色素变化较小，这为大批量测定试验样品提供了依据。本研究分别利用无水乙醇和水饱和正丁醇提取小米黄色素，无水乙醇提取液最大吸收波长平均 445.8 nm，水饱和正丁醇最大吸收波长平均 447.5 nm，和其他研究结果类似 7,8,15。叶黄素为小米中黄色素最主要组分，本研究中小米叶黄素最大吸收峰波长为 445.8 nm，这和报道的叶黄素波长基本相等 16，细微的波长
27、差异可能在于物质的纯度及测定误差。AACC 14-50测定小麦的黄色素含量测定波长为 435.8nm，其主要根据混合物中主要组分叶黄素设定测定的吸收波长 16，本研究中小米黄色素的吸收光谱和叶黄素吸收光谱最相似，叶黄素的最大吸收波长为 445 nm, 所以研究中测定的黄色素含量都为 445 nm下测定。研究中利用 -胡萝卜素制作的标准曲线，而小米黄色素主要成分为叶黄素和玉米黄质，- 胡萝卜素含量较少 5，小米黄色素为多种胡萝卜素或类胡萝卜素的混合物，所以测定的小米黄色素含量不是绝对含量，而是同一测定系统下的相对值。4 结论实验完善优化了小米黄色素的提取测定方法，以水饱和正丁醇为提取液，避光振荡
28、提取 3 h， 10 000g离心 8 min，在 445 nm下测定上清液吸光度，以 -胡萝卜素制作标准曲线，计算小米黄色素含量。该方法灵敏准确、精密度较高，能满足小米黄色素测定的要求。参考文献1Lu H, Zhang J, Liu KB, et al. Earliest domestication of common millet (Panicum miliaceum) in East Asia extended to 10,000 years agoJ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State
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