1、1鱼类树突状细胞研究进展陈孝煊* 1，李思思 ，周成翀，吴志新（华中农业大学水产学院，湖北省水生动物病害防控工程技术研究中心，淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，水产养殖国家级实验教学示范中心（华中农业大学），湖北 武汉 430070）摘要：树突状细胞（DCs）是目前已知的体内功能最强的抗原递呈细胞，是唯一能够激活初始T淋巴细胞反应的细胞，在先天性免疫、适应性免疫以及维持自身免疫耐受方面具有重要的作用，因此一直是免疫学研究的重要领域。本文简要综述了DCs的类型及其在动物体内的功能、各类DCs的细胞标记。总结了鱼类DCs的分离、纯化方法和形态学观察方法；现有研究表明，鱼类DCs具有吞噬细菌、刺激
2、T细胞增殖、诱导CD4 +T细胞的活化、表达DCs的标记基因、被Toll样受体的配体激活、迁移能力、引起混合淋巴细胞反应等生物学功能；不同鱼类DCs的分子标记并不完全一样；鱼类的头肾、肾、鳃、皮肤、胸腺、脾、肠等均有DCs的分布。目前，对鱼类DCs的研究虽然取得了一定进展，但仍有许多重要问题需要解决：鱼类DCs目前缺乏明确的细胞标记，加强这方面的研究有助于提高鱼类DCs的分离、体内分布与功能的研究水平；加强和完善鱼类DCs的分离、培养技术的研究，掌握各种鱼类DCs的分离培养方法；加强鱼类DCs在抗原递呈中的功能研究，对深入鱼类免疫机理研究，合理设计和应用疫苗，具有重要的理论指导意义。关键词：鱼
3、类；树突状细胞；形态；分布；细胞标记；功能中图分类号： 文献标志码：1 DCs的发现与分类1.1 DCs的发现树突状细胞（dendritic cell, DCs）是目前已知的体内功能最强的抗原递呈细胞，是唯一能够激活初始T淋巴细胞反应的收稿日期：2018-02-04 修回日期：资助项目：国家自然科学基金（31672683）通信作者：陈孝煊，Email: 共同第一作者2细胞 1-2。据报道，最早发现的一类DCs是朗格汉斯细胞（ Langerhans cell， LCs）。 1868年，Paul Langerhans3 发现了人皮肤中一种常驻的树枝状形态的细胞并命名为LCs。LCs 长期以来被误认
4、为是一种神经细胞，直到Steinman 4 发现了一种独特的细胞类型并进行了后续的相关研究，才确定LCs可作为定居在皮肤中的抗原递呈细胞。1973年，Steinman 和 Cohn5在体外培养小鼠脾脏细胞时发现了一群形态呈树枝状的细胞，并命名为DCs。后来Voohis6在人外周血液中亦发现这种细胞。 20世纪90年代中期， DCs在免疫学中的重要性被逐渐认识。有研究认为，小鼠淋巴器官DCs根据其是否表达CD8，分为两个亚型，具有不同的免疫功能 7。随后，有研究发现在非淋巴组织中功能表型与淋巴组织中CD8 + DCs相同的细胞，但不表达CD8，而表达整合素CD103 8。此外， DCs家族还被发
5、现有另一类特征类似于浆细胞的细胞群，在病毒感染时，会产生大量的干扰素- (INF-)，而且还能分化为经典的DCs，以抗原特异性的方式活化初始型 T细胞 9。自从在人类和小鼠中发现了DCs并进行形态和功能的研究之后，人们陆续在鸟类、爬行类、两栖类以及鱼类中发现DCs的存在，这些细胞与哺乳动物DCs形态、分子标记及功能相同或相似 10-14。 1.2 DCs的分类及功能 DCs来源于造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC），局部造血微环境对其发育起着重要的作用，如FMS 样酪氨酸激酶3配体（Flt3L ）、粒巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF ）、巨噬细胞集落刺激因子
6、（ M-CSF）、 型干扰素（INF-）等细胞因子。在这些不同细胞因子的刺激下，逐步由HSC分化发育为不同种类的DCs并分布到身体的各部位 15-17。根据DCs的表型、功能及分化来源等有不同的分类方法。根据成熟程度来划分根据细胞成熟度，DCs可以分为未成熟DCs（immature DCs, imDCs）和成熟 DCs（mature DCs, mDCs）两类。两种DCs 的形态、细胞表面标记物和免疫学特性不同。稳态条件下，体内绝3大多数DCs处于未成熟状态，未成熟DCs具有较强的抗原摄取及处理能力，其细胞表面低表达CD40、CD80、CD86 等共刺激分子和主要组织相容性复合体II类分子（MH
7、C），不能有效递呈抗原来激活T淋巴细胞，从而导致免疫耐受 18。未成熟DCs诱导免疫耐受的机制可能有激活T细胞凋亡、诱导T细胞免疫无能以及诱导调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）的产生等 19，因此未成熟DCs又被称为“耐受性DCs”（toterogenic dendritic cells)。成熟DCs通过细胞表面的抗原肽/MHC分子复合物将抗原递呈给初始T细胞，从而刺激初始T细胞分化为针对该种抗原的特异性细胞毒性T细胞，促进其分化增殖而发挥免疫效应 20，调节 Thl/Th2的发育，在免疫监视中发挥重要的作用 21。因此，DCs的抗原摄取和传递功能在机体先天性免疫、
8、适应性免疫和维持自身组织免疫耐受的过程中起着非常关键的作用 22。根据分化来源途径来划分根据分化来源，DCs主要分为髓样DCs（myeloid DCs, mDCs）和浆细胞样DCs （plasmacytoid DCs, pDCs)1。mDCs又称为传统DCs（conventional DCs, cDCs)， cDCs按照 T细胞分化的方向进一步分为诱导 Th0向 Th1分化的cDC1s和向Th2分化的cDC2s23。DCs 来源于骨髓HSC ，先分化为骨髓样和淋巴样前体细胞，骨髓样前体细胞再分化为单核细胞、巨噬细胞和DCs前体细胞 24-25， DCs前体细胞进一步分化为单核细胞、少量的巨噬细
9、胞和cDCs前体细胞（CDP） 26-27，最后CDP 再分化为DCs分支前体细胞，例如cDC1s和cDC2s前体细胞 28。cDC1s在小鼠中表型为CD8 +CD103+，在人体内表型为BDCsA3 +(CD141+)；cDC2s 在小鼠中表型为CD11b +CD4+CD8-，在人体内表型为BDCA1 +(CD1c+)23。CD1c +mDCs高表达一些活化分子以及Toll样受体18（TLR18)，能够分泌多种细胞因子，具有较强的摄取抗原的能力，并且产生免疫应答 29。CD141 +mDCs 交叉递呈病毒抗原的能力比其他DCs亚群强，研究者推测这可能与其高表达C型凝集素9家族A成员（CLEC
10、9A）有关，CLEC9A 有利于病毒感染后坏死细胞抗原的处理 30。pDCs在小鼠中表型为B220 +mPDCA1+Siglec-h+；在人体内表型为BDCA4 +BDCA2+23，pDCs可以通过表面的TLR7和TLR9识别病原体，4分泌大量的INF-，产生免疫应答 31。根据细胞学和生化性质来划分根据细胞学特征和生化特性，DCs可分为常驻性DCs（resident DCs）和移动性 DCs（migratory DCs)。常驻性DCs 存在于次级淋巴器官中，稳态下，常驻性DCs呈现出不成熟DC的表型并且低表达一些共刺激分子。移动性 DCs主要分布在不同的非淋巴组织，该亚群 DCs可进一步划分
11、间质性 DCs、LCs和外周血 DCs等，当其受到抗原刺激后移动性DCs能回到淋巴结定居 32-33。其中，LCs主要分布于表皮和胃肠道上皮，为未成熟 DCs，细胞质内含特征性结构-Birbeck颗粒。LCs另一特征性的标记是表达C型凝集素Langerin/CD207，其他细胞标记包括上皮细胞黏附分子EpCAM、F4/80、E-cadherin 、DEC205/CD205和CD11b 34。2 DCs的标记DCs是异质性很高的细胞类群，由多种功能、活性迥异的亚群组成 35。DCs目前没有公认的、统一的特异性标记，不同的细胞亚型都有其特异性的标记物。人DCs相对特异性的标记为CD1a、CD11c
12、和CD83。小鼠DCs相对特异性的标记为NLDCs145 和33D1。Coventry等 36认为， CD1a主要表达于人胸腺细胞、DCs（包括LCs ），是鉴定人外周血与骨髓中DCs的最好标记。 Prechtel等 37研究发现，CD83是DCs成熟的标记，体外培养的DCs 在早期不表达CD83 分子，当其成熟时才表达CD83分子，成熟DCs摄取抗原的能力降低而其激活T细胞的功能则增强。一些研究发现，cDCs 都表达CD11c 和MHCII，但不同的亚型都有其特异性的标记 38-39。在脾脏和淋巴结中，cDC1s表达CD8、CD24和XCR1，而cDC2s表达CD4和Sirp 40-41。非
13、淋巴组织中，cDCs均表达CD24，区别于表达CD64的巨噬细胞 42-44。 cDC1s表达CD103与XCR1，而cDC2s表达CD11b与Sirp。Guilliams等 45发现一种简单的标记分类：cDCs（CD11C +MHC+CD26+ CD64- F4/80-）、cDC1s（XCR +）以及cDC2s （Sirp +)。pDCs也表达CD11c和MHCII，此外还表达B220、Siglec-H和Bst2 46-47。目前已发现的 DCs 膜表面分子主要有 吞噬相关受体，包括 FcR、 FcR、TLR、补体受体、甘露糖受体； 抗原递呈分子，包括 MHCI/II分子、CD1 5分子；
14、共刺激分子 ，包括CD80、CD86 ；黏附分子，包括CD40、CD54、1/2 整合素家族等；细胞因子受体，包括粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子受体（granulocyte-macrophage colonystimulating factor receptor，GM-CSFR）、白介素-1 受体（interleukin-1 receptor，IL-1R）、IL-10R 、IL-4R 1。3 鱼类DCs与哺乳动物相比，鱼类的免疫器官缺乏骨髓和淋巴结，但鱼类的多种器官（组织）中均发现有树突状细胞（或类树突状细胞）分布。已有研究表明，DCs 在哺乳动物和鱼类中的功能和表型是保守的，鱼类的 DCs
15、有经典 DCs 的形态、相似的功能；不同鱼类 DCs 的分子标记也不尽相同。3.1 鱼类DCs的分离与鉴定鱼类DCs的分离与富集培养对鱼类DCs的研究，离不开DCs的分离培养培养技术，目前有关学者采用的分离方法主要是机械法和酶消化法。Bassity 等 11在对虹鳟（Oncorhynchus mykiss）DCs的研究中，即采用了这两种方法： 机械法：虹鳟用过量的 MS-222麻醉，尾静脉采血后，无菌条件下取头肾、脾脏、体肾的前部分置于L-15培养基中，用无菌注射器的活塞碾压组织并用L-15培养基冲洗使组织中的细胞通过70m 的细胞筛获得单细胞悬液；用L-15培养基调整活细胞数为6x10 6个
16、细胞/ml，置于25cm 2或75cm 2培养瓶中，室温培养730 d，期间收集非贴壁细胞，当细胞出现树突状的形态时，用Nycoprep/One-step monocytes（Accurate chemical, Westbury, NY）分离液进一步富集纯化得到类DCs细胞。从外周血分离 DCs的方法则是：从尾静脉取血用肝素处理后，用含有肝素的磷酸盐缓冲液稀释4倍，室温静置20min ，将富含白细胞的血浆置于Nycoprep1.077（Axis Shield, Oslo, Norway）分离液上，离心后收集白细胞，用L-15培养基重悬、调整细胞数为5x10 6 个细胞/ml ，置于25cm
17、2培养瓶中室温培养，2 h后弃非贴壁细胞，培养过夜后，DCs失去其贴壁性而悬浮在L-15培养液中。酶消化法：无菌条件下，从麻醉的虹鳟中取出脾脏，用胶原酶A处理获得6单细胞悬液，置于Nycoprep (Axis Shield, Oslo, Norway)分离液上，离心后收集白细胞；用L-15培养基重悬、调整细胞数为6x10 6 个细胞/ml ，置于6孔板中，室温培养，2 h后弃非贴壁细胞，培养过夜后，DCs失去其贴壁性而悬浮在L-15培养液中。Zoccola等 13在对尖吻鲈（Lates calcarifer）的研究中，通过机械法分离得到DCs，但富集纯化方法与Bassity等人的方法稍有不同：
18、鱼体麻醉致死，尾静脉取血后于无菌条件下取脾脏和头肾，置于L-15培养基中，用1ml无菌注射器的活塞碾压组织并用L-15培养基冲洗使细胞通过100m 的细胞筛获得单细胞悬液；用L-15培养基调整细胞数为1x10 7个细胞/ml，置于25cm 2或75cm 2培养瓶中，28培养5-14d；期间收集非贴壁细胞，当细胞具有树突状的形态时，利用不连续密度梯度Percoll分离液（d = 1.058 g/mL 和 d = 1.048g/mL）进一步富集纯化得到DCs细胞。此外，还可以利用DCs的特性以及通过荧光标记的方法分离DCs。利用头肾中的细胞对花生凝集素（PNA）的亲和力的差异，结合流式细胞分选技术
19、，Lugo-Villarino 等 10从斑马鱼（Danio rerio）的头肾中分离得到PNA hi 细胞，并证实这些细胞为DCs。Wittamer等 48在双转基因斑马鱼的头肾中分离出 mhc2dab:GFPhi, cd45:DsRedhi的单核吞噬细胞，发现其中DCs有一定的比例。鱼类DCs的形态通过Wright-Giemsa染色的方法，Lugo-Villarino 等 10在斑马鱼中发现具有DCs独特形态的细胞，细胞胞体向外伸出多个突起，这些突起在长度、宽度、形态和数目上都不同，胞体形态不规则，细胞核呈椭圆形或肾形，整体呈现星形或细长的细胞形态。其他多种染色方法也显示了典型DCs的特性
20、，例如酸性磷酸酶染色显示，DCs细胞核周围分布有较小的阳性颗粒；-醋酸萘酯酶染色显示，DCs染色较弱，细胞质内有黑色沉淀。对分离得到DCs进行超微结构观察，透射电镜结果显示，DCs从胞体向外伸出突起，细胞核常为较大的、弯曲的形态，且核膜周围分布着染色质，细胞质的电子密度较低且含有线粒体、溶酶体、多泡体等细胞器。此外，在皮肤中分离的DCs发现有“网球拍”状颗粒，类似于哺乳动物LCs中的Birbeck颗粒。Bassity 等 11从虹鳟脾脏和头肾分离培养2周后的DCs，在光镜下观察到 DCs出现分枝状突起。Wrig7ht-Giemsa染色显示，细胞形态不规则，核呈小裂片形状，其中一部分细胞的细胞核
21、呈三叶草型或花瓣型。在透射电镜下，发现细胞有不同程度的突起，细胞核常分为2叶或3叶，周围分布有染色质，细胞质中有内质网、高尔基体、线粒体等细胞器，但未发现“网球拍”状的 Birbeck颗粒。近年来的研究发现，在硬骨鱼类的脾脏和头肾中存在类似哺乳动物LCs的一类细胞。Lovy等 49在鲤形目（ Cypriniformes）的鲤（Cyprinus carpio）、狗鱼目（Esociformes）的白斑狗鱼(Esox lucius)、鲑形目（ Salmoniformes）的大西洋鲑（Salmo salar）、鲽形目（Pleuronectiformes）的大西洋庸鲽（Hippoglossus hipp
22、oglossus）等多种鱼类中发现类LCs ，具有典型的“网球拍”状的Birbeck颗粒，且围绕中心粒周围分布，但不同物种的Birbeck颗粒结构有差别。3.2 鱼类DCs的功能Lugo-Villarino 等 10发现，斑马鱼DCs除了具有典型的DCs形态外，还具有吞噬细菌的能力，高表达与 DCs相关的基因，例如il-12p40、 csf1r和 iclp1， 而且PNA hi DCs具有刺激T 细胞增殖的能力，同时DCs可诱导抗原特异性CD4 +T细胞的活化 50。Bassity 等 11发现， 在虹鳟中分离得到的DCs，除了具有刺激T淋巴细胞增殖能力外，还具有一系列类似哺乳动物DCs 的功
23、能，例如表达DCs的一些标记基因，能够吞噬小的颗粒，能够被TLR的配体激活，在体内具有迁移能力等。在尖吻鲈中的研究中，发现肽聚糖、脂多糖以及海豚链球菌（Streptococcus iniae）都能够诱导DCs 的迁移，与脂多糖相比，肽聚糖的诱导作用更为明显，DCs能够吞噬细菌和荧光微球以及刺激T淋巴细胞的增殖 13。在青鳉（ Oryzias latipes）中，类DCs也能引起强烈的混合淋巴细胞反应( mixed lymphocyte reaction, MLR)51。3.3 鱼类DCs的表面标记越来越多的研究表明，鱼类的DCs在激活B细胞和T细胞的功能上是保守的。由于DCs8具有异质性，DC
24、s的鉴定要依赖多个细胞标记的表达 52。在哺乳动物中，膜结合蛋白 CD83是成熟DCs的膜标记分子，膜结合蛋白CD83分子量为40-45KD，属于免疫球蛋白超家族成员，由胞外区、跨膜区和胞内区组成 37。未成熟DCs表面表达低水平的共刺激分子及 MHCII 类分子，而高表达一系列受体，如TLR、C 型凝集素等。DCs的表型与功能相适应，高表达的受体有利于未成熟细胞识别、摄取抗原相关的物质。一旦未成熟DCs受到炎性刺激，则会向成熟DCs转化，其中共刺激分子及 MHCII 表达水平显著提高，其意义在于提供 T 细胞活化的信号，如T细胞受体与MHC-抗原复合体结合传递信号，T细胞型CD28与CD80
25、/CD86 结合传递信号，从而启动获得性免疫应答 53-54。在硬骨鱼类中，对于DCs的分子标记还不确定。在虹鳟中，分离培养的DCs可表达TLR-3、TLR-5 、TLR-9、TLR-20、TLR-22、TLR-22L、B7R 、B7H1、B7H3、B7H4、IL12p40、CXCR4、CCR7 、MHCII 、CD83、CD209等DCs标记基因；DCs 在四种TLR配体（imiquimod, Poly I:C, ssRNA, flagellin）的混合物刺激下，CD83 发生显著性上调表达 11。在尖吻鲈中，发现了一种潜在的DCs标记-DCs-SCRIPT，在肽聚糖和脂多糖的刺激下，头肾和
26、脾脏中的DCs-SCRIPT都出现了不同程度的上调表达 13。有研究表明，CD80/86、CD83、CD209 以及MHCII共定位在斑马鱼DCs 的细胞膜上，而且在脂多糖和血蓝蛋白的刺激下，以上四种分子均出现显著性上调表达 50。3.4 鱼类DCs在体内的分布和哺乳动物相似，DCs在鱼体内的数量很少 6，但从不同组织均可分离得到一定纯度的DCs。在虹鳟、尖吻鲈的头肾和脾脏以及外周血中都分离培养得到了不同数量的DCs 11, 13。此外，通过绿色荧光蛋白标记MHC （mhc2dab:GFP ）和红色荧光蛋白标记CD45（cd45:DsRed）的方法，结合流式细胞术分离并研究了单核细胞和DCs在
27、转基因斑马鱼体内的特性，发现体内多数器官都有DCs的分布；DCs占单核吞噬细胞的比例在各器官中分别为：皮肤（15%）、胸腺（10%）、肾（6%）、脾（5% ）、肠（3% ） 48。Granja等 55在虹鳟皮肤中发现了MHCII +、CD8 + DCs样细胞，约占白细胞的1.2% ，且表现出与哺乳动物DCs相似的功能与表型。Lovy等 12在孢子虫感染的大鳞大麻哈鱼（Oncorhynchus 9tshawytscha）的鳃中，发现了LCs。随后，在大西洋鲑（ Salmo salar）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、美洲红点鲑（Salvelinus fontinalis）以及多
28、种辐鳍亚纲鱼类的头肾及脾脏中发现了LCs 49, 56。最近，Kordon等人在斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）的头肾、脾脏、鳃中也发现了类LCs 57。4 总结与展望哺乳动物DCs研究已较深入。近年来，在越来越多的鱼类中也发现了DCs，研究发现，鱼类DCs在功能和表型上与哺乳动物具有很多共性，但是仍然有很多问题亟待解决，例如DCs的细胞标记，加强这方面的研究有助于提高鱼类DCs的分离、DC类型及在体内分布与功能的研究水平； DCs的分离、培养技术； DCs在抗原递呈中的功能研究，以及DCs在鱼体中发挥功能的场所与调节机制等。随着技术的进步和研究的深入，鱼类DCs的生物学特
29、性以及DCs免疫调节的机制等问题将逐渐被解决，这对深入鱼类免疫机理研究，合理设计和应用疫苗，具有重要的理论指导意义。参考文献：1 Steinman R M. Decisions about dendritic cells: past, present, and futureJ. The AnnualReview of Immunology, 2012, 30:1-22.2 Collin M, McGovern N, Haniffa M. Human dendritic cell subsetsJ. Immunology, 2013, 140(1):22-30.3 Jolles S. Paul
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