1、核-壳型白藜芦醇分子印迹微球研制及应用作者：张明磊 张朝晖* 刘丽 张立吉 聂丽华 【摘要】 以表面修饰乙烯基团的 SiO2微球为基体，白藜芦醇为模板分子，丙烯酰胺（AA）为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）为交联剂，采用表面印迹技术制备核-壳型白藜芦醇印迹微球。采用红外光谱（IR） 、扫描电子显微镜（SEM）对该分子印迹微球进行表征，结果表明，SiO2 表面成功接枝一层厚度为 200 nm的印迹聚合物，该印迹微球颗粒分散均匀。采用高效液相色谱技术对印迹微球的吸附性进行研究表明，此印迹微球具有良好的识别性能，利用 Scatchard模型分析得出印迹微球的最大吸附量分别为 Qmax1=
2、9.087 mg/g和 Qmax2=13.80 mg/g。此印迹微球成功用于分离虎杖提取液中白藜芦醇。 【关键词】 分子印迹微球；白藜芦醇；吸附性能；核-壳型Abstract Employing resveratrol as template molecule，acrylamide as functional monomer and ethyleneglycol dimethacrylate as cross-linkers，a core-shell resveratrol imprinted microspheres was prepared based on the surface of
3、SiO2 with a surface imprinting technique.The molecularly imprinted microsphere was characterized by infrared spectroscopy and scanning electron microscopy，and the results showed that the surface grafting of molecularly imprinted polymer-shell particle on SiO2 was successful and the particles were ev
4、enly distributed.High performance liquid chromatography was also used to investigate the imprinted microsphere adsorption performance，and the results showed that the imprinted microsphere exhibited good recognition performance.The maximum adsorption capacities were Qmax1=9.087 mg/g and Qmax2=13.80 m
5、g/g by the model of Scatchard analysis.The imprinted micospheres was applied to separate resveratrol from the extraction of rhizoma polygoni cuspidate successfully.Keywords Molecularly imprinted microsphere；Resveratrol；Adsorption property；Core-shell1 引言近年来，新型印迹技术不断涌现，包括采用溶胶-凝胶技术进行本体聚合1，2，在硅胶表面进行表面聚合
6、35。前者聚合物存在模板分子包埋过深、难以洗脱、形状不规则、机械性能低等缺点;后者的表面印迹材料的大小可控，颗粒均匀，容易洗脱，尤其通过控制表面聚合壳层的厚度，可有效减少包埋现象。虎杖系蓼科属多年生草本植物，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰的作用，主要含有蒽醌类和芪类化合物，其中芪类成分白藜芦醇（Resveratrol）具有抗癌、抗氧化、抗自由基、抗细菌和真菌等作用6。目前，提取分离白藜芦醇的方法主要有溶剂提取和酶法提取7及印迹技术1。向海燕等以溶胶-凝胶法合成白藜芦醇印迹聚合物，但是其印迹聚合物模板分子包埋过深，难以洗脱，粒径不规则、不均匀。为了克服这些缺陷，本研究以 SiO2微球为载体，通
7、过接枝乙烯基三甲氧基硅烷（VTMOS） ，在 SiO2微球表面引入双键，合成核-壳型的白藜芦醇分子印迹微球，并用于分离虎杖提取液中的白藜芦醇。2 实验部分2.1 仪器与试剂LC-2010AHT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司） ；WGH-30A 型双光束红外分光光度计（天津港东科技发展有限公司） ；KQ-250E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司） ；LG10-2.4A 台式高速离心机（北京医用离心机厂） 。正硅酸乙酯（TEOS，Sigma 公司） ；丙烯酰胺（AA，分析纯）；白藜芦醇（标样，中国药检所） ；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA，Sigma 公司） ；偶氮二异丁腈（AIBN，
8、分析纯） ；乙烯基三甲基硅烷（VTMOS，Sigma 公司） ；乙腈（色谱纯） ；乙酸、无水乙醇、氨水、HCl（分析纯） ；虎杖（采自湖南张家界）粉末。2.2 印迹微球的制备2.2.1 SiO2微球的制备 11 向装有 49.5 mL乙醇的烧瓶中加入 2.0 mL氨水、6.3 mL蒸馏水和 2.23 mL TEOS，室温下以 700 r/min的速度搅拌，反应 12 h。收集产品，用乙醇冲洗，放入真空干燥箱中干燥，备用。2.2.2 SiO2微球的表面修饰 称取 SiO2微球 2.0 g，加入 8.0 mol/L HCl 60.0 mL，60 回流 12 h，过滤，滤饼用蒸馏水洗涤至中性后，14
9、0 下干燥 8 h，即可得表面活化的 SiO2微球。取 0.5 g表面活化的 SiO2微球，分散于 10.0 mL 50%乙醇的水溶液中，加入 0.75 mL VTMOS，50 下反应 24 h。硅烷化后，用乙醇在超声下洗去未反应的 VTMOS，然后于 100 下干燥 3 h，使 VTMOS与 SiO2表面的羟基充分交联键合，得到乙烯基修饰的 SiO2微球（VTM-SiO2） 。2.2.3 白藜芦醇分子印迹微球（MIPs）的制备3 取 200 mg VTM-SiO2颗粒分散于 100 mL乙腈溶液中，加入 170 mg（2.40 mmol）AA，1.83 mL（9.2 mmol）EGDMA，3
10、00 mg（1.3 mmol）白藜芦醇，和 100 mg（0.6 mmol）AIBN，在冰水浴下通入氮气 10 min。在 50 下聚合 6 h，然后升温至 60 下再聚合 24 h，控制搅拌速度为 300 r/min。产物在 85 下再反应 6 h，沉淀，最后用乙腈和乙醇洗涤，120 下干燥，将收集的白藜芦醇印迹微球（MIPs）用 V(甲醇)V(乙酸)=91 混合溶液在索式提取器中反复洗涤 24 h除去模板分子，120 下干燥。非印迹微球（Nonimprinted polymers，NIPs）的合成方法与分子印迹微球合成方法完全一致，只是在合成时不加入模板分子。2.3 印迹微球的吸附性能研究
11、及其表征2.3.1 静态吸附 取印迹微球 20.0 mg，8 份，分别置于吸附管中，各自加入 10.0 mL浓度为 0.10.4 mol/L的白藜芦醇的乙醇溶液，置于 25 恒温水浴超声波振荡器中，振荡 12 h后，以 9000 r/min速度离心分离，取上层清液用高效液相色谱测定平衡时白藜芦醇的浓度。检测波长 303 nm，流动相为 V(甲醇)V(水)= 4159， 流速为 1.0 mL/min。根据吸附前后浓度变化，计算对白藜芦醇的吸附量 Q。2.3.2 红外分析采用 WGH-30A型双光束红外分光光度计，对 SiO2微球、VTM-SiO2 微球、洗脱脱模板分子（白藜芦醇）前、后的 MIP
12、s进行红外表征。2.4 实际样品检测取 1.0 g洗脱后的分子印迹微球，装入直径为 1.0 cm、容量为10.0 mL的聚丙烯柱中，柱子的下端口用棉花塞住，从上口装入印迹微球，再塞上棉花，加入乙醇抽滤，使印迹微球在柱内排布紧密。 取 3.0 g虎杖原料粉末投入 100 mL圆底烧瓶中，加入 30.0 mL V(甲醇)V(乙酸)=82 混合溶液，超声 30 min，80 下回流 3 h，然后进行过滤，蒸出溶剂，用甲醇重新溶解，得虎杖提取液。取 5.0 mL虎杖提取液，注入提取柱，抽滤，收集过柱液，先用 5.0 mL甲醇冲洗提取柱，然后用 5.0 mL V(甲醇)V(乙酸)=91 混合溶液冼脱，收
13、集洗脱液，用 HPLC检测白藜芦醇的含量。图 1 SiO2微球表面印迹制备路线图（略）Fig.1 Synthesis routine of SiO2 moleculary imprined polymers3 结果与讨论3.1 印迹微球的制备及形貌表征以 VTMOS为连接 SiO2和 AA的媒介，采用热聚合技术，以白藜芦醇为模板分子，AA 为功能单体，EGDMA 为交联剂，经过 ABIN引发，在温和的条件下制备出包覆了白藜芦醇的印迹聚合薄层。经过甲醇-乙酸溶液洗脱后，白藜芦醇从印迹微球聚合薄层中洗脱出来，在印迹微球的薄层中留下对白藜芦醇具有特异吸收的空隙。SiO2 微球表面印迹微球制备路线如图
14、 1所示。制备的分子印迹聚合物微球有以下特点：在 SiO2微球表面引入了双键，增强了分子印迹聚合物薄层与载体之间的共价键作用力，使聚合物薄层牢固地聚合在微球表面；通过改变 VTM-SiO2，AA 和 EGDMA的比例，控制壳层厚度，有效减少了包埋，利于洗脱。研究表明，当 VTM-SiO2，AA 和 EGDMA的质量比为119，其壳层厚度可控制在 200 nm以下；可增强分子印迹聚合物微粒表面的记忆效应和机械性能。 图 2 SiO2和印迹微球的扫描电镜图（略）Fig.2 Scanning electron microscopic (SEM) images of SiO2 and molecula
15、rly imprinted polymers(MIPs)扫描电镜对 SiO2微球和 MIPs进行形貌分析的结果见图 2。SiO2微球粒径均匀（约为 200 nm） 、规则。MIPs 表面光滑，粒径均匀，粒径约为 600 nm。由此可估算表面印迹聚合物壳层厚度约为 200 nm。3.2 吸附实验采用静态吸附法，通过 HPLC检测，分别得出 MIPs和 NIPs对白藜芦醇的吸附等温线，如图 3a所示。结果表明，MIPs 对白藜芦醇具有较强的吸附能力，而 NIPs对白藜芦醇的吸附能力小，这表明 MIPs对白藜芦醇具有较强的印迹效应。进一步利用 Scatchard模型7分析，Scatchard 方程为
16、：Q/C=（QmaxQ）/Kd。式中，Kd 是接合位点的平衡解离常数；Qmax 是结合位点的最大表观结合量（mg/g） ；C 表示吸附平衡液的平衡浓度（g/L） 。以 Q/C 对 Q作图可得两条不同斜率的直线（图 3b） ， MIPs在研究浓度范围内对模板分子存在两种吸附的结合位点。根据斜率和截距可以得出亲和位点解离常数和最大表观结合量分别为 Kd1=0.1724 g/L， Qmax1=9.087 mg/g；Kd2=0.6018 g/L， Qmax2=13.80 mg/g。图 3 印迹微球和非印迹微球的吸附等温线(a)及 Scathchard曲线(b)（略）Fig.3 Adsorption i
17、sotherms(a) and Scatchard plots(b) of adsorption isotherms of MIPs and nonimprinted polymers(NIPs)3.3 红外光谱分析将 SiO2， VTM-SiO2， MIPs（模版洗脱后） 、MIPs（未洗脱模版）分别进行红外光谱分析(图 4)。比较图 4a和 4b可见，在 1413和 1637 cm1 有吸收峰，其中 1413 cm1 处是甲基的弯曲振动，1637 cm1 是CC的伸缩振动，这表明乙烯基硅烷成功的修饰到 SiO2微球表面。在图4c和 4d中，3500 cm1 是 OH的吸收峰，3150340
18、0 cm1 是 NH键的伸缩振动区域，1725 cm1 属于 C的伸缩振动。图 4d中，14501660 cm1 属于苯环的伸缩振动，3100 cm1 是苯环 CH和乙烯基 CH的伸缩振动，而图 4c却没有这些峰，这表明白藜芦醇分子可以从印迹微球表面洗脱干净。图 4 SiO2(a)、乙烯基修饰的 SiO2(b)、MIPs (模板洗脱后)(c)、MIPs (未洗脱模板)(d) 的红外图谱（略）Fig.4 IR spectra of SiO2(a)，SiO2 modified with vinyl(b)，MIPs(after eluting the template) (c)，MIPs (befo
19、re eluting template)(d)3. 印迹微球对虎杖提取液中白藜芦醇的分离采用 HPLC检测白藜芦醇标准溶液，确定白藜芦醇的出峰时间，分别检测虎杖提取液、过柱液、洗脱液中白藜芦醇的含量，如图所示。对比虎杖提取液（图b）和过柱液（图c）的色谱图，计算提取液中白藜芦醇的含量为 45.7%，过柱后溶液中白藜芦醇含量为 5.4%，这表明虎杖提取液通过印迹分离柱，白藜芦醇容易被印迹填充物吸附。用甲醇冲洗印迹柱后，再用 V(甲醇)V(乙酸)=91 混合溶液洗脱，收集洗脱液、检测，得色谱图d，柱洗脱液中白藜芦醇含量为 89.3%。结果表明，本印迹填充材料具有较强的吸附性能，白藜芦醇与印迹微球的
20、结合键比较牢固，能够将虎杖溶液中的白藜芦醇得到较好的分离。图 白藜芦醇标准液(a)、虎杖提取液(b)、过柱后溶液(c)和柱洗脱液(d)的液相色谱图（略）Fig. Liquid chromatograms of resveratrol standard solution(a)，extracting solution of rhizoma polygoni cuspidati(b)，after passing column(c) and eluate of column (d)【参考文献】1 Malaisamy R，Ulbricht M.Sep.Purif.Technol.， 2004，39(3)
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