1、近红外特征谱段相关系数法测定中药胶囊中添加枸橼酸西地那非【摘要】 利用近红外特征谱段相关系数法对中药胶囊中是否添加枸橼酸西地那非进行快速定性分析。分别使用近红外光谱仪的积分球和光纤附件测定光谱，以枸橼酸西地那非化学对照品的近红外光谱为参照光谱，选择特定谱段，根据枸橼酸西地那非被掺入胶囊中的最小起效浓度建立待测样品光谱与参照光谱在该谱段的相似系数阈值，定性判断待测样品是否含有枸橼酸西地那非。积分球方法：选择 60705800 cm1 和41704070 cm1 谱段，阈值为 70%，用 79 个含枸橼酸西地那非的市售样品验证该方法，相关系数大于 70%的有 72 个，占样品总量的 91.14%；
2、光纤方法：选定 60705800 cm1 谱段为特征谱段，设定阈值为 65%，用 247 个含枸橼酸西地那非的市售样品进行验证，相关系数大于 65%的有216 个，占样品总量的 87.45%。实验证明此方法具有较好的预测能力，可作为市场上该种非法添加药物的快速有效检查手段。 【关键词】 近红外漫反射光谱,相关系数法,定性分析,中药非法添加,枸橼酸西地那非1 引言近红外（NIR）光谱分析技术由于具有操作简便、分析速度快、不损伤样品等特点，已经逐渐成为分析领域的热点技术，近年来在药物分析领域被广泛应用13，且在打击假劣药品方面渐显优势4,5。中国药品生物制品检定所自 2003 年起开始研究应用 N
3、IR 分析技术进行现场假劣药品快速筛查的方法6。目前，所建立的近红外药品快速鉴别系统已经在全国 300 余辆药品检测车上使用。本研究组报道了利用 NIR 对片剂7,8 、粉针剂9,10 、胶囊剂11等西药的快速筛查方法和使用情况。目前，国内中成药的制假主要以非法添加化学药品为主，例如降血糖中成药中非法添加降糖化学药12。由于中成药成分的复杂性，使得采用常规的收集代表性样品建立 NIR 模型的方法很难得到稳健的模型。目前尚未见快速筛查中成药中非法添加化学药品的近红外分析方法的报道。本研究采用逆向思维，以被添加化学药品的 NIR 图谱为参照光谱，选择其在中成药中不受干扰的具有典型特征的光谱区域，利
4、用相似系数法与中成药的 NIR 图谱进行比较，通过设定合理的阈值，判定被测中成药中是否非法添加了该种化学药，并称此方法为特征谱段相关系数法。此方法简单易行，基本不受中成药处方的影响，故能对不同厂家的不同样品进行快速筛查。本研究采用近红外特征谱段相似系数法的建模方法，建立了快速筛查补肾壮阳类中成药中非法添加的枸橼酸西地那非方法。2 实验部分2.1 仪器与样品MPA 型近红外光谱仪（德国 Bruker 公司） ，配有积分球测样附件，硫化铅（PbS）检测器及 OPUS 6.5 光谱分析软件。MATRIXF 型光谱仪（德国 Bruker 公司） ，配有光纤探头测样附件，铟镓砷检测器及 OPUS 5.0
5、 光谱分析软件。 247 批非法添加枸橼酸西地那非的补肾壮阳类中成药由辉瑞公司提供，20 批不含枸橼酸西地那非的中药胶囊由中国药品生物制品检定所提供。2.2 实验方法近红外光谱的采集：积分球采样时，将胶囊内容物倒入标准瓶中采集光谱；光纤探头采样时，用光纤探头直接顶住胶囊的单层胶囊壳侧测定；光谱范围为 110004000 cm1，扫描累加次数 32 次，分辨率 8 cm1，每个样品重复测定 3 次，计算平均光谱。3 结果与讨论3.1 建立模型3.1.1 原理 分别比较枸橼酸西地那非对照品、非法添加了枸橼酸西地那非的样品和不含枸橼酸西地那非的对照样品的 NIR 图谱，在含枸橼酸西地那非样品的 NI
6、R 光图谱中寻找与枸橼酸西地那非对照品具有较高的相似性，但在不含枸橼酸西地那非对照样品的 NIR 光图谱中没有特征吸收的谱段，此称之为特征谱段；比较样品 NIR 光谱与枸橼酸西地那非对照品 NIR 光谱在特征谱段的相似性，以相关系数（r）为指标，通过选择合适的 r 值为阈值，判断样品中是否含有枸橼酸西地那非。r=Cov(y1(k), Y2(k)（y1y2） （）式中，r 为 y1(k)和 y2(k)的协方差（Cov）除以两张光谱标准偏差()的乘积。3.1.2 特征谱段的选择 将枸橼酸西地那非对照品、非法添加了枸橼酸西地那非的样品和不含枸橼酸西地那非的对照样品的 NIR 图谱经二阶导数法和矢量归
7、一化法（13 个平滑点）处理；经分段比较，在积分球采样得到的光谱图中，选定 60705800 cm1 和 41704070 cm1 谱段为特征谱段（图 1） ；在光纤采样得到的光谱图中，由于低波数区的干扰作用较强，选定 60705800 cm1 谱段为特征谱段（图） 。图 1 积分球采样(A)和光纤采样（B）的特征谱段的选择（略）Fig.1 Selection of characteristic spectral band of integrated sphere method（A） and fiber method(B)3.1.3 阈值的确定 准确称取不含枸橼酸西地那非的 92 号样品，向其
8、定量添加枸橼酸西地那非对照品，混合均匀后，置标准瓶中用积分球测定或装入胶囊中用光纤探头直接测定，比较不同样品 NIR 光谱与枸橼酸西地那非对照品 NIR 光谱在特征谱段的相似性（表 1） 。枸橼酸西地那非的有效剂量一般为 25100 mg，市售的中药胶囊内容物的质量一般为 0.250.50 g，要达到有效的剂量，市售中药胶囊中枸橼酸西地那非的含量一般应大于 5；结合表 1 的结果，确定将 r=70作为积分球采样的阈值；将 r=65作为光纤直接采样的阈值；其对应的对枸橼酸西地那非的检出限均为 2。表 1 对定量添加枸橼酸西地那非的实验室制备样品的预测结果（略）Table 1 Prediction
9、 results of the laboratory prepared samples added certain amount of sildenafil citrate3.2 模型验证3.2.1 准确性 积分球法预测 79 批含枸橼酸西地那非的样品，72 批样品 r 大于阈值（表 2） ，预测准确性大于 90；对 20 批不含枸橼酸西地那非的样品预测，r 在 0.00%21.63%之间。光纤法预测 247 批含枸橼酸西地那非的样品，216 批样品的 r阈值（表 2） ，预测准确性大于 85；对 20 批不含枸橼酸西地那非的样品预测，r 在 22.66%62.59%之间。可见模型对样品的预测
10、准确性较好，且积分球方法较光纤法更准确。表 2 近红外相关系数模型对含枸橼酸西地那非样品的预测结果（略）Table 2 Prediction results of 79 samples containing sildenafil citrate by NIR correlation coefficient method3.2.2 模型传递 为了验证模型的适用性，选取 10 批样品，在两台不同的近红外光谱仪中预测，不同仪器的预测结果基本一致（表 3） ，即模型的适用性比较好。表 3 不同仪器对样品的预测结果（略）Table 3 Prediction results by different in
11、struments3.3 模型的应用2008 年 1012 月，国家食品药品监督管理局组织在全国范围内对中成药中非法添加化学物质进行专项监督检查和抽验，中检所组织了 11 个省、市药品检验所对上述近红外模型结合专项检查工作进行了进一步的验证。共抽验到各类补肾壮阳类中成药 244 批，利用药品检测车中装备的近红外光谱仪，采样光纤法直接测定，41 批经 LCMS 确证含有枸橼酸西地那非的样品，利用近红外法筛查出 31 批；203 批不含枸橼酸西地那非的样品，近红外法的筛查结果均正确；总体正确率为 93.4%。说明本研究建立的近红外快速筛查模型具有实用性。此模型在 2009 年将装备到各药品检测车中
12、作为常规筛选方法。【参考文献】1 Luypaert J, Massart D L, VanderHeyden Y. Talanta, 2007, 72（）: 865883 hu XiaoLi( 褚小立), Xu YuPeng( 徐育鹏), Lu WanZhen( 陆婉珍). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2008, 36(5):7027093 Roggo Y, Chalus P, Maurer L, LemaMartinez C, Edmond A, Jent N. J. Pharm. Biomed.Anal., 2007, 44（）: 683700 Mukhop
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