1、免疫学及免疫学检验,REVIEW QUESTION The specificity of the reaction of antigen with antibody is usually highly dependent upon 1)molecular weight of the antigen 2)charge of the antibody 3)immunoglobulin isotype 4)conformation of the reactants,免疫学及免疫学检验,沉淀反应（precipitation reaction)毛旭虎医学检验系临床微生物学及免疫学教研室二OO六年二月,免
2、疫学及免疫学检验,可溶性抗原+相应抗体 肉眼可见的沉淀,免疫学及免疫学检验,1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应 抗血清混合出现沉淀1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于 其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性 免疫试验向定量化发展 免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、 微量、自动化的新阶段。,免疫学及免疫学检验,根据沉淀反应的介质和检测方法的不同,沉淀反应可分为: 液相内的沉淀反应 凝胶内的沉淀反应,免疫学及免疫学检验,第一节 液体内沉淀试验 根据沉淀现象的
3、不同，液体内沉淀又可分为三类： 絮状沉淀 环状沉淀 免疫浊度沉淀,免疫学及免疫学检验,一、絮状沉淀试验 絮状沉淀试验是一项经典实验技术。曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验是絮状沉淀的代表试验，现今已被更简便而敏感的USR或RPR方法替代。,免疫学及免疫学检验,(一) 原理 抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。絮状沉淀易受抗原与抗体比例的影响，由此可作为最适比测定的基本方法。,免疫学及免疫学检验,(二) 操作步骤1. 抗原稀释法(1) 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。(2) 各管加入一定浓度的适量抗血清。(3) 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37孵育。(
4、4) 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。,免疫学及免疫学检验,免疫学及免疫学检验,2. 抗体稀释法 本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体反应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。3. 方阵滴定法 抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard)滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。,免疫学及免疫学检验,(三) 方法评价 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，受抗原抗体比例影响非常明显，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。,免疫学及免疫学检验,二、环状沉淀试验 环状沉淀(ring precipitation)试验
5、是由Ascoli于1902年建立的一种经典的血清学定性试验。用非常简便的技术了解待测血清内是否存在某种抗原或抗体。,免疫学及免疫学检验,(一) 原理 把抗原溶液小心地加于已含抗体溶液的细试管液面上。当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳 白色沉淀环。,免疫学及免疫学检验,(二) 操作步骤1. 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管(内径 约1.52mm)底部，避免产生气泡。2. 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。3. 置沉淀管于室温下使其反应，15min内 在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。,免疫学及免疫学检验,(三) 方法评价 该试验是
6、经典的血清学反应之一，简便、快速、实用。故用于鉴定血迹和诊断炭疽(Ascoli试验)。只能定性，不能定量、敏感性较低(320mg/L)，对含有多个抗原抗体对的反应系统缺乏分辨力。方法难以推广。,免疫学及免疫学检验,三、免疫浊度试验 经典的免疫沉淀试验是抗原和相应抗体在反应终点时判定结果，方法存在耗时、敏感度低(10100mg/L)和不能自动化等缺点。70年代以来，根据抗原和抗体所在液相内快速结合并产生浊度的原理，建立了免疫比浊法。临床常用3种微量免疫技术，即透射比浊法(transmission turbidimetry)、散射比浊法(nephelometry)和免疫胶乳比浊法(immunola
7、tex turbidimetry)，借助多种自动化分析仪器来完成。,免疫学及免疫学检验,(一) 透射比浊法1. 原理 抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物(IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。,免疫学及免疫学检验,2. 操作步骤(1) 用稀释缓冲液将待检样品和标准品按规定稀释，取一定量加至测定管中。(2) 加最适工作浓度(用方阵法预先滴定)的抗体，孵育一定时间，测定吸光度(A)
8、值。(3) 以不同浓度抗原含量为横轴，吸光度为纵轴，绘标准曲线。从标准曲线可得待检抗原量。,免疫学及免疫学检验,3. 方法评价 敏感度高于单相琼脂扩散试验510倍，批内、批间重复性较好，变异系数48h，使用普通坐标纸作图，扩散环直径平方和浓度呈线性关系。(2) Fehcy曲线：适用于较小分子抗原，扩散时间较短，使用半对数坐标纸作图，抗原量的对数和扩散圈直径之间呈线性关系。,免疫学及免疫学检验,(三) 方法评价 单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L。,免疫学及免疫学检验,(四) 影响因素1. 抗原分子量 抗
9、原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。,免疫学及免疫学检验,2. 抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.11IU/ml，马抗血清为110IU/ml，羊为0.44IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。,免疫学及免疫学检验,3. 抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。下图为抗体分别
10、以1:25、1:50、1:75、1:100稀释，所形成的4条标准曲线。,免疫学及免疫学检验,免疫学及免疫学检验,4. 扩散时间 抗原达到扩散终点后，其沉淀环直径才与抗原含量呈一定关系。抗原含量越高，达到一定关系所用扩散时间越长。,免疫学及免疫学检验,5. 扩散温度 在437范围内，提高温度加快扩散速度，缩短反应时间。但有的沉淀环仅在低温下形成，温度高反而消失。在同一次试验的孵育过程中，要防止温度急剧变化，以免出现双圈。6. 琼脂板厚度 琼脂板厚度增加，沉淀环面积相应缩小。,免疫学及免疫学检验,二、双相琼脂扩散试验(一) 原理 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自
11、由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。,免疫学及免疫学检验,(二) 操作步骤1. 融化琼脂，浇板 每张载玻片约4ml。2.凝固，打孔 孔径3mm，孔间距35mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。3. 加样 在相对孔内加抗原或抗体。4.孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。,免疫学及免疫学检验,(三) 双相琼脂扩散试验的应用1. 检测未知抗原或抗体 将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中，根据沉淀线有无定性
12、；根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量；根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的相对扩散速率，见图 。,免疫学及免疫学检验,A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B ： Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag Ab ；D： 扩散率近似，浓度Ag Ab ；E：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab ；F：浓度Ag Ab，扩散率Ag Ab,沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系,免疫学及免疫学检验,2. 抗原性质分析 利用三角孔型，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图 。,免疫学及免疫学检验,(1) 沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。(2) 沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。(3) 沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。(4) 沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。,A1：待检抗原；A2：标准抗原,免疫学及免疫学检验,3. 抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。,免疫学及免疫学检验,
