1、壳聚糖凝胶的温敏性及其药物缓释性能研究作者：林友文， 方圆圆， 孟晓丹【摘要】 目的 研究壳聚糖/甘油磷酸钠(CS/GPS)水凝胶的温敏性及载药凝胶缓释性能。 方法 试管倒置法研究不同配比、不同 pH对 CS/GPS体系凝胶化性能的影响；红外光谱表征 CS/GPS复合物；紫外分光光度法考察温敏凝胶相变动力学曲线，并测定载药凝胶的累积释放度。 结果 56% GPS与 2% CS体积配比从 0.2增到 0.8（混合液 pH 6.5）,在 37 下凝胶化时间(GT)从 10 min缩短到 1.5 min；56% GPS/2% CS 体积比为 0.4的混合液，pH 6.5 升至 7.0，37 下 GT
2、从 120 s减少到 90 s；56% GPS与 2% CS以体积配比为 0.2时（混合液 pH 6.9） ，在 25 时维持液相，温度从 30 升至 45 ，GT 从 9 min降至 1 min，在 37时，可快速凝胶化（GT 为 130 s） 。依诺沙星为模型药物，载药凝胶 12 h累积释放度为 62%，依诺沙星原药 3 h累积释放度达到 97%。 结论 一定配比 CS/GPS体系在 37 具有快速凝胶化特性，温敏性载药凝胶对药物具有缓释作用。【关键词】 壳聚糖； 水凝胶类； 依诺沙星； 迟效制剂； 生物相容性材料近年来,基于温度敏感性的在体原位凝胶给药系统成为药剂学及生物材料领域研究的热
3、点13 ，其特点是以液体给药后，在药用部位因温度变化刺激（体温 37 ）而发生相转变，固化或形成凝胶，从而控制药物的释放。可用于眼部给药、鼻腔给药、局部注射给药等4，可有效改善药物的生物利用度，也可作组织修复植入给药56 。用于温敏凝胶给药系统的高聚物主要有聚 N 异丙烯酰胺、聚乙二醇/交酯(PEG/PLGA)嵌段共聚物、泊洛沙姆和壳聚糖（2 氨基2 脱氧D 葡萄糖，chitosan，CS）等3,79 ，其中 CS为天然阳离子多糖，具有良好生物相溶性、可生物降解性、来源丰富等特点，在药物控释、智能生物材料等方面具有良好的应用前景。研究发现 CS/甘油磷酸钠体系（Glycerphosphate，
4、GPS）水凝胶具有温敏性，并用于药物控释系统，但有些配方在 37 下凝胶化时间较长（最短的是 50 min）10,在临床应用上有一定的局限性。笔者研究在 37 下可快速凝胶化的 CS/GPS体系，并以依诺沙星为模型药物，考察载药凝胶的体外药物释放行为。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂 CS（大连鑫蝶甲壳素有限公司，脱乙酰度 95%，分子量 50 000） ，GPS（美国 Alfa Aesar公司） ，依诺沙星（福建建东药厂，批号 20061109） ，其他试剂均为分析纯（上海化学试剂公司） 。1.1.2 仪器 超级恒温器(501 型，上海实验仪器厂有限公司)，精密 pH计（pHS3B
5、 ，深圳市誉达科技有限公司） ，恒温振荡器(SHAB型，南京安铎贸易有限责任公司） ，可见紫外分光光度计（UV9200 ，南京昕航科学仪器有限公司） ，红外光谱仪（Avatar 330FTIR,Thermo Nicolet公司） ，电子分析天平（AL104，梅特勒 托利多仪器上海有限公司） 。1.2 方法1.2.1 CS/GPS体系温敏性实验 2 g CS溶解在 100 mL盐酸(0.1 mol/L)溶液中，配制成的 2% CS溶液，移取一定体积的 2% CS溶液于试管中，按比例逐滴加入 56% GPS溶液，振荡混匀后，以少量的 NaOH稀溶液（0.02 mol/L）调节混合液的 pH值。放入
6、水浴恒温器恒温，参照文献11用试管倒置法研究 GPS/CS配比、pH 及温度等条件对 CS/GPS体系凝胶化性能的影响。观察凝胶化现象，记录凝胶化时间(GT)。1.2.2 CS/GPS体系凝胶相变动力学曲线 移取一定体积的 2% CS溶液于试管中，按比例逐滴加入 56% GPS溶液，振荡混匀后，以少量的NaOH稀溶液（0.02 mol/L）调节混合液 pH 6.9，混合液转入比色皿中，装有混3 讨 论CS是甲壳素脱乙酰基后得到的天然线性高分子，在生物医用材料、药物制剂方面应用日趋广泛12,9 。CS 内富含氨基和羟基，可形成氢键，因此 CS不溶于水和有机溶剂。在酸性溶液中 CS上的碱性氨基能够
7、质子化形成 NH3+，使 CS分子链间带同种电荷而相互排斥，CS 分子可溶于（稀）酸溶液中。GPS为弱碱性化合物(pKa 6.34)，结构中存在羟基和磷酸根负离子，是对人体安全的双官能团阴离子偶联剂，磷酸根负离子可与壳聚糖的质子化氨基 NH3+通过静电引力作用交联，使壳聚糖溶液产生凝胶化，形成三维凝胶网络。凝胶网络的形成与环境温度有关，凝胶机理一般是认为与凝胶中存在的静电作用，氢键及亲、疏水平衡有关1,14。GPS与 CS二者间存在着三类型的相互作用力平衡，一是 CS链间的静电斥力及 CS与 GPS的静电引力平衡；二是氢键作用平衡，如 CS链间氢键作用、CS 与 GPS间、CS 与水的氢键作用
8、；三是 CS的疏水作用。这些相互作用力的平衡都会随温度的改变而改变，CS/GPS 水凝胶体系从而表现出温度敏感性1。加入弱碱性的 GPS，可部分中和壳聚糖 NH3+，削弱了 CS分子链间的静电斥力及与水的氢键作用。加适量的 GPS时，在低温（25 ）下，因壳聚糖与水的氢键作用仍较强，加上 GPS位阻作用，阻止了壳聚糖链的凝胶化交联。但随着温度升高，NH3+质子热运动增加，弱碱性的 GPS可以成功地夺取 NH3+上的质子，使 CS的 NH3+数量进一步下降，CS 分子链间氢键作用增强，同时 CS与水之间氢键作用减弱，疏水作用占主导地位，于是 CS分子链出现交联形成凝胶15。透光率随温度变化的凝胶
9、动力学曲线显示，在 37 附近透光率急剧降低，并出现拐点，出现凝胶化。凝胶化复合物的 IR光谱与 CS、GPS 的 IR谱图比较，吸收峰的变化和位移说明二者不是简单的物理混合，GPS 与 CS之间存在偶极静电作用（磷酸根和 CS的质子化氨基）以及羟基间的氢键作用，也从另一方面说明凝胶机理与 CS/GPS混合液存在的静电作用，氢键及疏水平衡有关。随着 GPS用量比的增加，GPS 夺取更多 NH3+质子，加速 CS链间静电斥力减弱，使 CS/GPS溶液在 37下凝胶化时间减少，或在较低的温度下就可以凝胶化。但用量增大到一定时（如 56%GPS与 2%CS等体积混合） ，因中和电荷、溶液碱性提高及溶
10、解达到饱和等诸多因素使混合液中的 CS沉淀析出。显然，pH 值对凝胶化也有影响。一定的 pH值范围内，升高CS/GPS的 pH值，溶液中质子减少，则游离氨基多，CS 链间静电斥力减小，分子链间氢键作用增强，使 CS/GPS在 37 时的凝胶化时间也减少（图 2） 。当 pH7.2 时，因 CS的溶解性降低而沉淀析出。而当 pH值较低时（pH4） ，氨基质子化程度高，同时抑制 GPS磷酸质子解离，CS链以静电排斥占主导，不易交联凝胶化。具有温度敏感性的给药系统，载药凝胶缓慢地、持续地释放药物，长时间与作用部位发生紧密接触并吸收药物，避开首过效应，提高药物的生物利用度；可减少给药次数，延长药物生物
11、半衰期，增加药物疗效。在温度敏感性原位凝胶给药系统的实际应用中，既要求体系具有在生理温度（37 ）快速凝胶化的特性，又要求在常温（25 ）时保持液相制剂的稳定。本实验选用 56% GPS/2%CS体积配比为 0.2，常温时可持续保持液相，30 min内未出现凝胶化，当温度升高至 37 时，凝胶化时间为 130 s，适合于载药实验及缓释性能考察。结果载药凝胶 12 h累积释放度为 62%，依诺沙星原药 3 h累积释放度达到 97%，实验结果表明 CS/GPS凝胶体系对药物依诺沙星有明显的缓释作用。其药物缓释时间较其它凝胶骨架体系对药物的缓释时间（数天）短，这是因为这种温敏凝胶含水量大，具有较大的
12、网络孔道，小分子药物较易通过凝胶网络孔道扩散逸出，文献报道小分子亲水性药物在此系统中数 h可完全释放16。此外，药物在此凝胶系统的释放速度还与药物相对分子质量的大小有关2。本实验中不同配比的 CS/GPS体系在 37 时均有快速凝胶化的特性（GT 为 75130 s） ，CS 和 GPS均具有良好的生物相容性，温敏性载药凝胶对药物具有缓释作用，CS/GPS 是温度敏感性给药系统的理想载体。【参考文献】1 Chenite A, Chaput C, Wang D, et al. Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegra
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14、eraturesensitive copolymers based on NisopropylacrylamideJ.Biomaterials, 2004,25(25):56595666.4 张翠霞,张文涛,王东凯,等. 新型的药物传递系统 原位凝胶的研究进展J. 中国医院药学杂志, 2006,26（4）:459461.5 Kamel A H. In vitro and in vivo evaluation of Pluronic F127based ocular delivery system for timolol maleateJ. Int J Pharm, 2002,241(1):47
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19、 for the delivery of hydrophilic moleculesJ. J Control Release, 2002,82(3):373383.合液的比色皿放入水浴恒温器恒温 3 min后，取出用擦镜纸快速擦干，参照文献12分光光度法，450nm 处测定 CS/GPS混合溶液的透光率随温度变化，绘制凝胶相变动力学曲线。对照样品 2% CS溶液同法测定。1.2.3 红外光谱表征 凝胶化的 CS/GPS复合物进行过滤，烘干，研磨，KBr 压片，红外光谱检测。1.2.4 载药凝胶的制备及体外药物释放实验 精确称取一定量依诺沙星于试管中，加入 2% CS溶液，振荡使药物溶解后，逐滴
20、加入56%GPS并混匀，37 水浴加热使其凝胶化，制成载药凝胶。同法制备空白凝胶（不加依诺沙星） 。分别配制不同浓度的依诺沙星标准溶液, 参照文献13在分光光度计测定 262nm 处测其吸光度值 A，以浓度(C) 吸光值(A)作标准曲线，进行线性回归得到的拟合方程为:A=0.097C-0.0069(R2=0.999)将一定量载药凝胶小心地从试管中移至一端已封口的透析袋中，PBS 5 mL（pH 7.4）淋洗试管，淋洗液转入透析袋中，并扎紧另一端封口。将透析袋放入装有 PBS（pH 7.4）195 mL的锥形瓶中。将此锥形瓶放入振荡器中，恒温 37 ，调转速 100 r/min进行实验。定时取样
21、 3 mL（并及时补充 37 的 PBS 3 mL，维持介质总体积为 200 mL） ，将各时间点的样品以 PBS为对照，在波长 262 nm处测定各时间点处的吸光值A1。同时测定空白凝胶的吸光值 A2，载药凝胶中药物吸光值 A=A1-A2，代入标准曲线计算浓度 C，求各时间点处载药凝胶中药物累积释放度（%） 。同法测定依诺沙星原料药在相同条件下体外释放的累积释放度（%） 。平行实验 3次，以 xs表示。2 结 果2.1 GPS/CS配比对凝胶化时间影响 56% GPS与 2% CS体积配比从 0.2增加到 0.8（混合液 pH 6.5）,在 37 下 GT从 10 min缩短到1.5 min
22、（图 1） 。随着 GPS用量的增加，GT 减少，但 2%CS与 56%GPS等体积混合时析出沉淀。2.2 pH对凝胶化时间影响 56%GPS/2%CS 体积比为 0.4 的混合液，pH 6.5升至 7.0，37 下 GT从 120 s减少到 90 s（图 2） 。当 pH 7.2时因 CS溶解度减小而产生沉淀析出。GT：凝胶化时间； GPS：甘油磷酸钠； CS：壳聚糖.2.3 温度对凝胶化时间影响 不同配比 56%GPS/2%CS混合液（pH 6.9）的凝胶化时间随不同温度而变化。温度升高，凝胶化时间均减少，在 37 时均有快速凝胶化的特性（GT 为 75130 s） 。体积配比为 0.2的
23、 56% GPS/2% CS混合液，常温时可持续保持液相， 30 min内未出现凝胶化，当温度升高至 37 时，GT 为 130 s。故选定该配比的 CS/GPS体系为载药实验，考察载药凝胶的缓释性能（表 1） 。表 1 温度对壳聚糖/甘油磷酸钠（CS/GPS）体系2.4 凝胶相变动力学曲线 CS/GPS体系（v56%GPS/v2%CS =0.4，pH6.9）的透光率随温度升高而变化的凝胶动力学过程（图 3）显示，随着温度从 20 升高到 30 ，CS/GPS 体系的透光率缓慢降低，在37 附近因凝胶化出现，透光率急剧降低，并出现拐点，40 以后固化，透光率几乎为 0。而 2% CS溶液的透光
24、率随着温度从 20 升高到 45 ，未见变化。图 3 壳聚糖/甘油磷酸钠(CS/GPS)溶液（v56%GPS/v2%CS =0.4，pH6.9）及 2%壳聚糖(2%CS)透光率随温度变化曲线 CS/GPS溶液（v56%GPS/v2%CS =0.4，pH6.9）及 2%CS透光率随温度变化曲线2.5 CS/GPS复合物红外光谱表征 凝胶化复合物的 IR光谱不同于 CS和 GPS的 IR谱图中CH2 在 2 8602 950cm-1 处的 CH 伸缩振动吸收峰有明显增强（图 4） ，而 GPS中典型的 P=O伸缩振动吸收双峰925 cm-1和 950 cm-1，在复合物位的 IR谱图中位移至 910 cm-1和 970 cm-1出现。吸收峰的变化和位移说明 GPS的磷酸根和 CS的氨基存在偶极静电作用，以及羟基间的氢键作用，而不是简单的物理混合。2.6 载药凝胶的体外药物释放 依诺沙星原药 3 h累积释放度达到 97.7%，载药凝胶 12 h累积释放度为 62%，实验结果表明 CS/GPS凝胶体系对药物依诺沙星有明显的缓释作用(图 5)。图 5 载药凝胶与依诺沙星原药的累积释放曲线
