1、联苯双酯固体脂质纳米粒的制备作者：张洪，詹新安，成蓓，谭晔【摘要】 目的 以乳化蒸发 低温固化法制备联苯双酯固体脂质纳米粒。方法 在单因素考察的基础上以正交试验优化、筛选最佳处方和制备工艺。用透射电镜观察固体脂质纳米粒的形态，激光粒度仪测定 Zeta 电位和粒径大小，葡聚糖凝胶柱法测定其包封率。结果 所制得的联苯双酯固体脂质纳米粒外观形态圆整，粒度分布均匀，平均粒径为（1936）nm,电位为（-21.51.2）mV，包封率为（45.11.1）。结论 乳化蒸发低温固化法适用于联苯双酯固体脂质纳米粒的制备。 【关键词】 联苯双酯；固体脂质纳米粒；乳化蒸发-低温固化法Abstract:Objecti
2、ve To prepare bifendate-loaded solid lipid nanoparticles by emulsification-evaporation. Methods Based on the result of single factor experiments,four factors affecting the formulation were optimized by orthogonal design. The diameters and the Zeta potentials were measured. TEM was used to observe th
3、e particle shapes,and the encapsulation rate was determined by Sephadex gel chromatography. Results The mean particle size was found to be 1936 nm with a narrow particles distribution of polydispersity index. The Zeta potential of the optimized bifendate-loaded solid lipid nanoparticles was (-21.51.
4、2) mV,and the drug entrapment efficiency was (45.11.1). Conclusion The method of emulsification-evaporation was appropriate for the preparation of bifendate-loaded solid lipid nanoparticles.Key words:bifendate; solid lipid nanoparticles; emulsification-evaporation固体脂质纳米粒( solid lipid nanoparticles,S
5、LN ) 作为控制药物释放的新型载体给药系统,引起了人们广泛的关注。它以固态的可生物降解的类脂性化合物为载体,将药物包裹于类脂核中,形成平均粒径在501 000 nm 的固体胶粒给药体系。SLN 既具备聚合物纳米粒物理稳定性高、药物泄漏慢的优势,又兼具了脂质体、乳剂的毒性低、可大规模生产的优点,可以增加药物的稳定性、控制药物的释放、避免药物的降解以及良好的靶向性等,是一种极有发展前景的新型给药系统的载体1,2 。联苯双酯(bifendate，DDB)系合成五味子丙素的中间体3 ，是 20世纪 80 年代我国自行研制成功的抗肝炎药，由于其降转氨酶作用显著，且能降低血中胆红素水平及 -甲肽蛋白的分
6、泌，显著改善临床症状，在我国及其他多个亚洲国家广泛应用于乙肝及丙肝的治疗4 。由于联苯双酯水溶性较差，临床上只有口服制剂，且生物利用度较低。本文以单硬脂酸甘油酯、卵磷脂作为载体材料，采用乳化蒸发-低温固化法5制备联苯双酯固体脂质纳米粒（DDB-SLN） ，控制粒径大小，通过静脉注射给药，期望可改变 DDB 的体内分布，提高肝脏局部的药物浓度，更好地发挥其治疗作用。1 仪器与材料戴安 P680 分析型高效液相色谱仪(美国)；高分辨透射电镜(JEM-2010UHR,日本电子公司)；Zetasizer 3000 型激光粒度仪（英国 Malvern公司） ；UV-2800 紫外可见分光光度计 （尤尼柯
7、仪器有限公司） ；JJ-2 增力电动搅拌器（江苏金坛市医疗仪器厂） ；精密恒温水浴锅（江苏金坛市医疗仪器厂） 。联苯双酯原料药（浙江万邦药业 批号：070301） ；联苯双酯对照品（中国药品生物制品检定所 批号：0192-950150） ；单硬脂酸甘油酯 （上海化学试剂有限公司） ；卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司） ；泊洛沙姆 188 （深圳优普惠公司） ；葡聚糖凝胶（G-50,pharmacia 公司） ；其余试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 DDB-SLN 的制备 精密称取处方量的 DDB、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂溶于适量的无水乙醇中，于（752） 水浴下形成有机相。另取泊洛沙姆溶于相
8、同温度的水中，保温，构成水相。在搅拌(1 000 r/min)下将有机相用针头注入水相中，整个过程保持温度在脂质材料熔点以上。搅拌 2 h，浓缩体积至原来的 1/2 左右。将所得的半透明体系快速分散于 02 水相中，继续搅拌 1 h，即得固体脂质纳米粒混悬液。2.2 含量测定方法2.2.1 检测波长选择 精密称取 DDB 对照品 10 mg，用 2 mL 的乙腈溶解，甲醇稀释至 50 mL，振摇得 DDB 浓贮备液。以浓贮备液配制质量浓度为 10 g/mL 的 DDB 甲醇标准溶液，同法配置空白溶液作为参比，用紫外分光光度计于 200400 nm 的波长范围内扫描。结果 DDB 在228、27
9、8 nm 均有较大吸收，考虑在低波长范围内有溶剂干扰，故选择278 nm 为检测波长。2.2.2 色谱条件 色谱柱：ASM-Kromasil-C18（150 mm4.6 mm，5 m） ；流动相：甲醇-水（6535） ；流速：1.0 mLmin-1；检测波长：278 nm；进样量： 20 L；柱温：35 。DDB 对照品，空白 SLN和载药 SLN 的色谱图见图 1。A.联苯双酯对照品;B.空白纳米粒;C.联苯双酯固体脂质纳米粒图 1 高效液相色谱图（略）Fig.1 HPLC chromatogram2.2.3 标准曲线 分别精密量取浓贮备液0.2、0.8、1.5、2.5、4、6 mL 置 1
10、0 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，得质量浓度为 4、16、30、50、80、120 g/mL 的一系列标准溶液，分别取 20 L 进样分析，以峰面积(A)对浓度(C)进行线性回归，得回归方程:A=0.65107+0.69761C,r=0.9999。结果表明 DDB 的甲醇溶液在 4120 g/mL 之间，线性关系良好。2.2.4 回收率试验 分别精密称取 DDB 对照品 4、5、6 mg 置 100 mL 量瓶中，加 2 mL 乙腈溶解，再加入处方量单硬脂酸甘油酯、卵磷脂及F68，甲醇定容。过滤，分别取续滤液 20 L 进样，根据测得的药物量和加入的药物量来计算回收率。结果平均回收率为 98
11、.68，RSD 为0.21。2.2.5 精密度试验 以浓贮备液分别精密配制质量浓度为10，50，100 g/mL 的低、中、高 3 种浓度的 DDB 甲醇溶液，于 1 d 内测定 5 次，计算日内精密度；每天测定 5 次，连续测定 5 d，计算日间精密度。结果日内精密度 RSD 为 0.26，日间精密度 RSD 为 0.39。2.3 包封率测定 以 Sephadex G-50 葡聚糖凝胶柱色谱法分离 DDB-SLN 和游离药物，测定其包封率。吸取 1 mL DDB-SLN 混悬液上柱，蒸馏水洗脱，收集带有乳光部分的洗脱液，定量吸取该部分洗脱液，加乙腈并超声，破坏纳米粒。另吸取 1 mL DDB
12、-SLN 混悬液，直接加乙腈并超声提取。HPLC 法分别测定两样品中 DDB 的含量，按下式计算包封率：包封率=m 柱/m 总m 柱为 DDB-SLN 混悬液通过 Sephadex G-50 后测得的联苯双酯的含量；m 总为 DDB-SLN 混悬液直接破乳后测得的联苯双酯的含量。2.4 单因素实验 对制备工艺中影响粒径的主要因素作进一步考察,结果发现有机相（乙醇）和水相的体积比为 13，乳化温度为 75 ，转速为 1 000 r/min 时，制备的 DDB-SLN 的粒径较小。2.5 正交设计试验及方差分析由单因素实验得知,各种乳化剂的比例、载体材料的用量和投药量对DDB-SLN 的粒径和包封
13、率有较大的影响。因此,选择 DDB(A)、 单硬脂酸甘油酯（B） 、卵磷脂(C) 、泊洛沙姆 188 (D)用量 4 个因素，以正交表L9（34）进行实验,各因素安排见表 1，正交试验结果及方差分析见表2、表 3。表 1 正交设计的因素和水平（略）Tab.1 Factors and levels of orthogonal design 表 2 正交试验的结果（略）Tab.2 Results of orthogonal experiment注：综合评分6= (粒径的最高值每次测得的粒径值)0.5（每次包封率的值包封率的最小值）0.5，其中 0.5 为粒径和包封率的权值。表 3 方差分析结果（略
14、）Tab.3 Results of variance analysis注：根据直观分析法的结果，以第三列作为误差列进行方差分析，F0.05（2，2）19 由表 2 可知，本实验 4 个因素 R 值的大小为BADC，其中 B 因素：K1K2K3，方差分析结果表明，B 因素有显著影响（P0.05） ，A、C、D 因素无显著性影响（P0.05） 。选取显著因素的最高水平，并综合直观分析的结果，初步确定最佳处方为A1B1C2D2，即：DDB 5 mg，单硬脂酸甘油酯 50 mg，卵磷脂 80 mg，泊洛沙姆 188 150 mg。2.6 形态观察按照优化后的处方制备样品，样品用质量分数为 2的磷钨酸染
15、色，然后滴至铜筛网上，室温放置至形成薄膜后，用透射电子显微镜观察。从透射电镜照片（见图 2）可以看出，DDB-SLN 的形态为类球形实体粒子，外观形态较圆整。图 2 DDB-SLN 透射电镜照片（29000） （略）Fig.2 Microphotograph of DDB-SLN by transmission electron microscope (29000)2.7 粒径和 Zeta 电位DDB-SLN 混悬液用激光粒度仪测定 SLN 粒度及分布，结果平均粒径为193 nm（见图 3） ，基本成正态分布，多分散指数为 0.217，由此可知纳米粒的粒径较均匀。Zeta 电位与纳米粒体系的稳
16、定性密切相关，本实验所制的纳米粒 Zeta 电位的平均值为-23.2 mV（见图 4） ，由此可知该纳米体系较稳定。 图 3 DDB-SLN 的粒径分布图（略）Fig.3 Size distribution of DDB-SLN图 4 DDB-SLN 的 Zeta 电位分布图（略）Fig.4 Zeta potential distribution of DDB-SLN2.8 验证性试验按照优化后的处方制备 3 批 DDB-SLN，测定粒径和包封率，结果见表4。表 4 DDB-SLN 的平均粒径和包封率（略）Tab.4 Mean size and the encapsulation effica
17、cy of DDB-SLN由上表可知，采用乳化蒸发低温固化法制备 DDB-SLN，重现性较好。3 讨论本文采用乳化蒸发低温固化法制备了联苯双酯的固体脂质纳米粒。载体材料为单硬脂酸甘油酯和卵磷脂，表面活性剂以泊洛沙姆为主，卵磷脂为辅，两者混合使用可得到较小的粒径和较高的稳定性，制得的纳米粒均在 100400 nm 范围内。据文献报道，在此范围内的微粒，静注具有被动肝靶向性7 。由于联苯双酯脂溶性较好，因而主要处于卵磷脂与泊洛沙姆 188 形成的乳化层中(可能有部分联苯双酯被泊洛沙姆形成的胶束增溶于其中)8 。当将体系分散于冰水浴的水中时，温度骤降，在高速搅拌下，单硬脂酸甘油酯开始凝固，在水中形成
18、固态纳米粒混悬液，部分联苯双酯被包封于卵磷脂单硬脂酸甘油酯的纳米粒体系中。如降温时间过长，由于不能瞬时固化，因而使形成的纳米粒或乳滴保留了一定的软黏性，在沉降过程中，乳滴或纳米粒会相互碰撞发生粘连，使形成的粒子粒径增大9 。高温梯度有利于脂质的快速固化，并可防止发生聚合10 。单硬脂酸甘油酯的熔点在 55 左右,在制备过程中温度应高于此值，最终确定加热温度为 75 。制备初乳时,比较搅拌速率对粒径的影响时发现:搅拌速率过低,粒径有增大的趋势,且放置稳定性明显变差；而转速过大，乳化时会产生大量泡沫，影响表面活性剂的乳化效果，最终确定转速为 1 000 r/min。关于包封率的测定，曾尝试用超速离
19、心法，但由于主药的脂溶性比较高，游离药物在以水为溶剂的体系易析出，无法准确测出上清液中游离药物的含量。采用葡聚糖凝胶法测包封率，先收集蓝色乳光部分（纳米粒） ，再加乙腈超声处理破坏纳米粒体系，直接测定被包在 SLN 里面的药物含量，结果较可靠。载体材料与药物的相容性可显著影响纳米粒的包封率。分析联苯双酯在单硬脂酸甘油酯纳米粒包封率不高的原因，两者极性相差较大，相容性较差可能是其主要原因;在载体材料中加入混合脂质（如山嵛酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯等）或液态脂质（大豆油、Miglyol 812） ，可有望提高包封率11 。【参考文献】1 RAINER H，MULLER R H,KARSTEN M,e
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