1、脑弥漫性轴索损伤实验装置的研制及动物模型的建立作者：刘晓斌，宋锦宁，陈景宇，张芬茹，刘守勋【摘要】 目的 自制一种脑弥漫性轴索损伤(DAI)装置并成功建立 DAI 动物模型。方法 自制头颅瞬间旋转损伤装置，使大鼠头颅在瞬间(3 ms)旋转 90造成剪切损伤。观察损伤后大鼠的生命体征及行为学改变；于伤后 2、6、12、24、36、72 h 及 10 d 分别处死损伤组动物，制备脑石蜡切片，行镀银及 HE 染色，光镜下观察神经轴索变化。结果 伤后大鼠均即刻出现原发昏迷，其中 2 只于损伤后 20 min 内死亡，余持续时间 1-30 min 不等；伤后大鼠呼吸节律紊乱，瞳孔对光反射减弱或消失，醒后
2、均有程度不等的反应性下降，肢体活动迟缓；肉眼可见广泛蛛网膜下腔出血或脑室出血；光镜下可见皮髓交界区、胼胝体区、脑干、小脑白质等部位的神经轴索有不同程度的肿胀、断裂、轴索球形成，后期有小胶质细胞增生，局部呈巢样聚集。结论 本装置能造成大鼠脑DAI，且具有简便、可控、确切的特点，适合进行中、小型动物 DAI 模型的实验研究。 【关键词】 弥漫性轴索损伤 实验装置 动物模型 大鼠ABSTRACT: Objective To design a new experimental facility to induce rat diffuse axonal injury model. Methods Rat
3、 diffuse axonal injury was induced by a new experimental facility, which was developed to let the rat head spin 90 degree at the moment to cause shearing injury. Vital sign and behavior of rat were measured simultaneously. The rats were sacrificed at 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 72 h and 10 d after i
4、njury, respectively, and the brain tissues were removed to prepare paraffin section. Then silver staining and HE staining were conducted to investigate changes of axonal fibers. Results There were unconsciousness, respiratory rhythm disturbance and hyporeflexia of pupil light reflex immediately afte
5、r injury, and reactiveness decrease and activity retardation still existed even after resuming consciousness. At anatomical scene, subarachnoid hemorrhage or cerebroventricular haemorrhage were widespread. At an early stage, there were swelling, collapse, and axonal retraction ball formation at cort
6、ico-medulla junction, callosum, brainstem, and cerebellar white matter under microscope. But at the later stage, gitter cell proliferation and nest-like aggregation were major pathophysiological changes at focal brain tissue. Conclusion The new experimental facility is suit able to be used to induce
7、 rat diffuse axonal injury, since it is convenient, controlable, and precise.KEY WORDS: diffuse axonal injury; experimental facility; animal model; rat弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury, DAI)是一种常见的特殊类型的脑外伤，致残率和死亡率高，其致伤机制目前仍在不断地研究、探索中。因此，使用可靠的致伤装置建立一个合理且可重复的 DAI 动物模型，对深入细致地研究 DAI 具有重要意义。根据 DAI 可能的生物力学机制，我
8、们参照 Smith 和贺氏旋转损伤装置1-2 ，自制了大鼠头颅瞬间旋转损伤装置并成功建立了大鼠脑 DAI 模型。1 材料与方法1.1 DAI 损伤装置的设计及制作1.1.1 原理DAI 最常见于车祸颅脑损伤患者。车祸伤患者受力复杂，同时混有旋转加速-减速运动。根据这一受伤机制，我们参照国内、外有关旋转损伤装置，自制一瞬间旋转加-减速损伤装置，可使大鼠头颅在瞬间旋转15-90，并在极短时间内减速停止运动，造成大鼠脑损伤。1.1.2 组成 固定部分：包括门齿孔、一对横向杆及双侧耳棒(门齿孔长 2 cm，门齿孔距耳棒 4 cm；横向杆长度 7 cm，间距 6 cm)。驱动弹簧：由优质粗钢丝制成，经烘
9、烤定型后安装固定在旋转装置的轴承上，预先扭转 180使其处于备用状态，此时与轴承连带之横向杆呈上下排列。驱动弹簧备有 5 圈 7 mm、6 圈 6 mm、7 圈 6 mm 等不同规格，可根据不同要求进行更换。本实验使用的是 6 圈 6 mm 规格的驱动弹簧。回位旋纽：用扳子将其顺时针拧动 90，可使横向杆由上下排列变为水平排列。扳机：向下按动，弹簧可获释放，固定部分遂以横向杆连线中点为轴心逆时针转动 90。旋转角度限位孔：备有 15、30、45、60、75、90限位孔，将限位销插入任一孔，按下扳机后固定部分即由水平位逆时针转至该孔所标角度。驱动弹簧力量调节孔：备有 6 个与旋转角度限位孔对应的
10、调节孔，可调节驱动弹簧的力量以用于不同的实验要求。限位盘：限位盘有 90 弧度的空间，通过与限位孔中的限位销撞击，可产生角加速旋转后的减速运动，更能模拟 DAI 的实际致伤状况(图1)。1.1.3 使用 使用时装置固定在一个稳定的实验台上。动物麻醉后头颅经耳棒及门齿孔固定于横向杆上,躯干与实验台成 30角俯卧于厚 20 cm 的海绵垫上，选定旋转角度，按动扳机，弹簧驱动固定部分旋转，使头颅于冠状面逆时针快速转动至预定角度，随即限位盘与限位销撞击产生瞬间急速停止，完成致伤。顺时针拧动回位旋钮，卸下动物，使装置处于备用状态进行下次致伤。1.2 DAI 模型的建立 选取健康成年清洁级 SD 大鼠 2
11、4 只，雌雄各半，体重 250-355 g，随机分为正常对照组和致伤组，其中致伤组又分为伤后2、6、12、24、36、72 h、10 d 七个亚组，每组 3 只。各组大鼠经 100 g/L 水合氯醛麻醉(0.2-0.3 mL/100 g)后，固定于旋转装置上。致伤组大鼠苏醒后出现较剧烈挣扎后，在挣扎间歇期，按动扳机，致其头颅瞬间旋转 90。正常对照组大鼠苏醒后即从装置上卸下。记录各组大鼠生命体征及行为变化。损伤组在预定时间、正常组在观察 6 h 后，用 100 g/L水合氯醛腹腔麻醉，快速开胸，左心室插管至主动脉，灌注 9 g/L 生理盐水至流出液清亮后，换 40 g/L 多聚甲醛溶液灌注，至
12、大鼠四肢及尾巴抽搐、双肺及肝脏变白为止(灌注压：12.5-15.6 kPa，以上操作于 10 min 内完成)；灌注完成后即迅速取脑，完整剥离全脑(脑干、小脑及大脑)同时肉眼观察大体病理变化，每组标本组织投入 40 g/L 多聚甲醛溶液于 4 下后固定 48 h；大脑、小脑沿冠状面自中线切开，脑干沿正中矢状面切开，分别洗涤 24 h，常规脱水、透明、浸蜡，包埋制成蜡块备切片用。每组标本的蜡块均自后向前行连续切片，片厚 5 m，取连续 6 张切片裱片，其中 3 张用于 HE 染色，另外 3 张用于 Glees-Marsland 镀银染色。2 结 果2.1 大鼠伤后生命体征及行为学变化 致伤组大鼠
13、伤后均立即出现不同程度的原发性昏迷，表现为无自主活动，刺痛无防御性反应；瞳孔对光反应消失或迟钝，角膜反射减弱或消失，闭眼或无睁眼活动。昏迷持续时间 1-30 min 不等，平均 11.67 min。其中 1 例损伤严重者于致伤后 5 min 出现口鼻及双侧外耳道流血，四肢抽搐呈去大脑强直状，随即呼吸停止，死亡。观察生命体征变化发现，致伤组大鼠伤后均有呼吸节律紊乱，表现为呼吸深慢到浅快，最后清醒恢复正常节律；有 6 只大鼠伤后出现小便失禁现象。致伤组昏迷清醒后(昏迷清醒的判断标准：出现复正体位；瞳孔对光反应恢复；刺痛反应明显)的表现：反应迟钝，不思饮食，持续约 10 h；四肢活动减少、迟缓，行走
14、不稳，持续约 8 h。正常对照组大鼠麻醉清醒后从装置上卸下，其生命体征正常，活动自如，反应敏捷，迅速逃跑。2.2 大鼠神经病理学改变 正常对照组大鼠肉眼无病理改变。光镜下 HE 染色见神经元形态结构完整，胶质细胞分布正常；微血管管壁完整，内皮细胞形态结构正常，管腔内无微血栓形成；死亡的大鼠死后立即解剖取脑，肉眼见脑干区硬膜下血肿形成及广泛蛛网膜下腔出血。致伤组大鼠肉眼可见广泛蛛网膜下腔出血及脑室出血，脑底面可见小针尖样出血灶，无脑挫裂伤；光镜下 HE 染色轴索球难与神经元胞体区别，故 HE 染色不易发现轴索球，但可观察到伤后 12 h 神经元肿胀，至 24 h 神经元坏死达高峰， 36 h 后
15、开始出现胶质细胞增生聚集现象，10 d 后仍明显(图 2)。正常对照组大鼠脑组织光镜下 Glees-Marsland 镀银染色见大、小脑白质及脑干神经轴索走行自然、光滑，粗细基本均匀，排列紧密；致伤组大鼠伤后 6 h 在大脑矢状窦旁皮髓交界区、脑干头端、小脑白质区可见迂曲肿胀的轴突，12 h 后可见明显的轴索球形成，至 24 h 后，轴索球最明显、典型，数量最多；72 h 后轴索球减少，但胶质细胞增生明显，10 d 后轴突损伤性改变明显减轻，胶质细胞弥漫性增生(图 3)。3 讨 论DAI 在重型颅脑损伤中占 28%-42%，病死率高达 42%-62%，是导致颅脑损伤患者重残和植物生存的最常见原
16、因3 。各种暴力均可造成头颅瞬间旋转，使脑在惯性趋导下作非线性加/减速运动，期间产生的一种与旋转轴相垂直的剪切力。这一剪切力作用于桥静脉，引起蛛网膜下腔出血，作用于脑实质微血管，可致脑组织内点状出血，作用于神经纤维，致轴索损伤。DAI 以交通事故伤多见。这是因为车祸时头部处于活动状态，由于脑各组织间的物理质量不同，其运动速度不均，易受剪力作用引起白质广泛损伤造成 DAI4-6 。有关 DAI 研究的动物模型，国内外已有较多研究。目前主要用于研究 DAI 的模型有液压损伤模型、加减速损伤模型、牵拉损伤模型及瞬间旋转损伤模型。因旋转角速度使脑内产生剪切力的损伤模型比其他模型更符合 DAI 的受伤机
17、制，故目前认为，头颅瞬间高速旋转是制作脑 DAI动物模型的理想致伤方式7-8 。本实验在参照 Smith 及贺氏旋转损伤装置的基础上，根据旋转角加速度及减速性损伤机制，自行设计、制作了一套瞬间旋转加/减速损伤装置，以大鼠为研究对象进行 DAI 研究。本装置以大鼠脑质量为中心，通过一个性能可靠、重复性好的弹簧为驱动力，带动与固定鼠头部件相连的轴承在瞬间作沿冠状面的高速侧向旋转，当转动至预定角度时，通过与轴承同轴转动的限位盘撞击限位销，使运动突然停止。本装置在致伤过程中经过两次加速度：一是驱动弹簧通过头部固定部件使鼠头作弧形角加速度旋转，此过程为加速性角加速度；当撞击固定杆后，使运动突然停止，带动
18、鼠头作第 2 次加速度，此次加速度为减速性角加速度。因此，鼠头在旋转过程中经历了一个加速度减速度的变化。本装置致伤的大鼠，伤后均出现原发性昏迷，且有呼吸节律紊乱等脑干功能的异常，严重者可以死亡。大体病理可见蛛网膜下腔出血、脑室出血，其中死亡的大鼠在脑干区有硬膜下血肿形成；组织切片嗜银染色在脑干、大脑灰白质交界区、小脑白质等区域可见轴索肿胀、断裂，轴索球形成等 DAI 特征病理像，脑干和胼胝体的纤维束间可见点状出血灶。上述病理与临床表现是一致的，这不但表明本装置可用于制作大鼠脑 DAI 模型，而且也提示了旋转剪切性损伤是导致脑 DAI 的确切生物力学机制。本装置与其他旋转损伤装置最大的不同点是：
19、增加了一个与旋转轴承同轴转动的限位盘。在按下扳机释放驱动弹簧，使大鼠以其脑质量为中心逆时针瞬间侧向旋转(经门齿孔及双侧耳棒固定大鼠头部，其脑组织即位于旋转受力的中心)后，在旋转到预定角度时，限位盘与限位销撞击而突然停止旋转，随即产生一次减速性角速度损伤。这样一种加速度减速度损伤过程更加符合临床实际。临床上 DAI 患者多见于交通事故伤，头部致伤力以旋转暴力和直线加减速暴力为主9 ，故在实际受伤过程中，头部将会经历加速度-减速度性的损伤作用。此外，本装置还设计了驱动弹簧限位孔，可以通过改变驱动弹簧的力矩来调节驱动弹簧的力量，从而满足不同的实验要求；本装置制作简便，各部件均可拆卸、更换，当装置较长
20、时间不用时，可卸下驱动弹簧力量调节孔处的销子，使弹簧处于无张力状态，减少对弹簧弹性系数的影响，保持驱动力的恒定，延长使用寿命；本装置操作简便，致伤效果明显可靠；固定部分牢靠稳定，限位销可随时更换，当冲击力作用于限位销时不会对装置造成破坏，故可重复多次使用。用本装置建立的动物模型有如下优点：使用大鼠为研究对象，来源经济，便于观察；实验方法简单合理，可重复性强；与实际致伤力学方式相符合；病理结果显示在脑干、大脑灰白质交界、胼胝体、小脑白质等存在 DAI 的病理改变。因而，本装置是一种合理的较为理想的的 DAI 损伤装置，可用于建立大鼠 DAI 模型。【参考文献】1Smith DH, Chen XH
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