1、胚胎期豚鼠前庭终器细胞凋亡的检测作者：胡金玮，黄维国，姜鸿彦，王锦玲，刘顺利，邱建华 【关键词】 生长和胚胎发育 关键词: 前庭终器;脱噬作用;生长和胚胎发育 摘 要:目的 研究豚鼠胚胎正常发育期前庭终器形态变化及细胞凋亡，探讨细胞凋亡在前庭终器发育中的作用. 方法 选用胚胎 40 和 50d正常豚鼠，光镜观察其前庭终器发育形态变化，末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物 dUTP 缺口末端标记技术（TUNEL）测定毛细胞和支持细胞凋亡，并以电镜观察凋亡细胞胞核变化. 结果 胚胎 40d，豚鼠前庭壶腹、椭圆囊斑及球囊斑已分化，前庭上皮出现一层毛细胞及多层支持细胞;胚胎 50d，支持细胞层数减少，毛细胞
2、数目增加，伴有神经纤维出现.TUNEL检测提示大量毛细胞和支持细胞发生凋亡.电镜下前庭上皮细胞发生分化，凋亡的毛细胞和支持细胞胞核染色质浓缩边集.凋亡细胞与新生细胞相邻. 结论 细胞凋亡是豚鼠内耳前庭终发育的必然现象，凋亡的发生对保证内耳正常结构和功能密切相关. Keywords:vestibular end organs;apoptosis;grouth and em-bryonic development Abstract:AIM The morphological changes and cell apopto-sis of vestibular organ in normally de
3、veloping guinea pigs were observed to elucidate the effect of apoptosis in the de-veloping vestibular organ.METHODS Guinea pigs of em-bryonic day（ED）40and50were studied.The morphological changes in the vestibular organ were observed by light micro-scope and apoptosis by TdT-mediated deoxyuridine tri
4、phos-phate-biotin nick end labelling（TUNEL）method and trans-mission electro microscopy（TEM）.RESULTS Ampullary cristae or macula of saccule and utricle were well differentiat-ed in ED40.There were a layer of hair cells and several lay-ers of supporting cells.The number of hair cells increased and tha
5、t of layers of supporting cells decreased，accompanied by the appearance of neural synapses.The differentiated hair cells and supporting cells underwent apoptosis in vestibular sensory epithelium，and were close to newborn cells.CONCLUSION Apoptosis is the necessary phenomenon in vestibular end organs
6、 of developing guinea pigs.It may be re-lated to the guarantee of the normal structure and the func-tion of inner ear. 0 引言 脊椎动物内耳发育中，有关细胞增殖、分化的研究已十分详尽，但对于细胞凋亡的报道却为数不多.鸡1 、大鼠 2 、小鼠3 及人类4 胚胎中，于耳泡区域发现凋亡细胞，有关细胞凋亡的功能及机制尚无定论.鉴于豚鼠内耳结构近于人耳，是内耳研究领域中重要的实验对象.目前尚未发现有关豚鼠内耳发育过程中细胞凋亡的研究资料.我们利用光镜、电镜和 TUNEL 技术，观察不同
7、胚胎期豚鼠内耳前庭终器的正常发育及细胞凋亡，旨在探讨细胞凋亡在内耳发育中的意义. 1 材料和方法 1.1 材料 根据雌鼠出现阴道栓及其体质量和体形变化，选择怀孕40 和 50d 白色豚鼠.戊巴比妥纳（50mgkg-1 ，ip）全身麻醉，40gL-1 多聚甲醛心脏灌注固定.迅速取下胎鼠双侧听泡，挑开蜗顶及底回骨壁，去除蹬骨，自蜗尖灌注固定，置于同样固定液中，4冰箱 8h. 1.2 方法 HE 染色标本制备 :将内耳标本以 0.1molL-1 B冲洗后，置于 100mLL-1 EDTA，常温下脱钙12h，250gL-1 蔗糖浸泡，4过夜.100gL-1 明胶定向包埋，标本于 Leica 恒冷箱切片
8、机，平行于蜗轴切片，厚度 10m.干燥后，切片置入 Harris 苏木素液染细胞核，10gL-1 盐酸乙醇分化，返蓝，5gL-1 伊红复染，切片脱水，透明，光镜下观察;TUNEL 检测:采用细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士得生物工程有限公司）.ED40 和 ED50 前庭组织切片，TBS 漂洗后，新鲜配制 30gL-1 H202 室温处理 10min;蛋白酶 K（1100，TBS 稀释）室温消化 5min;标本加标记缓冲液室温 10min 甩掉，TdT 和 DIGdUTP（11）加入标记缓冲液混合，加于标本上，37标记 2h;加封闭液，室温 20min;生物素化抗地高辛抗体（1100，封闭液稀释）
9、 ，37反应 30min;SABC（1100，TBS稀释） ，37反应 30min;DAB 显色.阴性对照省去 TdT.每步骤间以 TBS 漂洗 2min3 次.切片依次脱水、透明、封片;电镜标本制备:内耳标本于显微镜下剥离壶腹，球囊斑及椭圆囊斑，置于 25mLL-1 戊二醛液固定 12h，10gL-1 锇酸后固定 2h，丙酮梯度脱水，丙酮及环氧树酯浸透包埋.于 LKB nova 型超薄切片机行超薄切机行超薄切片，厚70nm.醋酸双氧铀，枸橼酸铅双染，JEM2000EX 电镜观察并照相. 2 结果 2.1 光镜观察 胚胎 40d 豚鼠前庭终器中，可见壶腹、椭圆囊斑及球囊斑完全分化.壶腹上方为一
10、层高柱样毛细胞，核呈圆形，体积较大，淡染;细胞质丰富，嗜酸性.下方可见二层支持细胞，胞核小，呈椭圆型，深染，紧密压集;细胞质极少.椭圆囊斑及球囊斑可见上方一层毛细胞及下方 35 层支持细胞.前者体积明显增大，胞质丰富;支持细胞内几乎看不见胞质，胞核排列紧密.毛细胞胞核较支持细胞为大，着色淡;胚胎50d 豚鼠前庭终器壶腹感觉上皮中，上方为一层毛细胞及一层支持细胞，在两侧延续为双层支持细胞，下方可见神经纤维.椭圆囊斑和球囊斑感觉上皮可见一层毛细胞及二层支持细胞，结构特点同前. 2.2 TUNEL 检测 胚胎 40 和 50d 豚鼠壶腹、椭圆囊斑毛细胞和支持细胞均可见核染色为棕黄色细胞，呈强阳性细胞
11、，即凋亡细胞（Fig1）.上方一层圆形、体积较大的为毛细胞胞核，下方椭圆形、体积较小的为支持细胞胞核.凋亡细胞数目较多. 2.3 电镜下观察 胚胎 40d 豚鼠前庭终器:壶腹、椭圆囊斑和球囊斑中均可见凋亡细胞，以椭圆囊斑内较多（Fig2） ，其中支持细胞发生凋亡数目比毛 细胞多.感觉上皮上方多为毛细胞，胞体较大.凋亡毛细胞胞核染色质浓缩，边集，不均匀，有些区域胞膜形成泡状隆起，包裹部分胞核凝积染色质而形成凋亡之小体;胞质内可见内质网明显扩张，由于水分积聚，内质网膜结构损伤，而致变性、自溶，出现于凋亡早期.支持细胞位于感觉上皮下方，胞体小.凋亡支持细胞染色质同样浓缩边集，与部分胞质脱落形成凋亡小
12、体.同时可见新分化毛细胞，特点形态小、核较大，以常染色质为主，胞质内可见大量溶酶体、高尔基复合体和线粒体，提示细胞功能活跃.球囊斑感觉上皮下层可见刚分裂的两个支持细胞，胞核靠近，核小胞质少，胞核与胞质已分离;胚胎 50d 豚鼠前庭终器:毛细胞可区分为型和型;型呈烧瓶样，型为柱状.壶腹、椭圆囊斑及球囊斑感觉上皮中可见凋亡的毛细胞和支持细胞（Fig3） ，数目较 40d 有所减少.超微结构变化特点同胚胎 40d 相似.同时在型毛细胞下方已形成神经纤维突触，其内含有大量突触小泡，呈空泡状.感觉上皮下方出现大量神经纤维，已形成髓鞘.偶可见凋亡的神经胶质细胞. 3 讨论 豚鼠内耳正常发育过程已有报道5，
13、6 .豚鼠在啮齿类动物中孕期较长，约 67d.胚胎 30d 时，壶腹开始形成，随后膜迷路分化为椭圆囊和球囊.毛细胞最早出现于此期，随细胞分化，数目逐渐增加，表皮板形成，胞质内含大量小泡，无神经支配.胚胎 40d 时，壶腹大体形态已形成，呈嵴状突起，尚无终帽.椭圆囊斑及球囊斑为弧形上皮组织，无耳石.上方为一层毛细胞，呈高柱样，分化良好，数量增加，表皮板已完全发育，上覆静纤毛;下方可见 23 层支持细胞，其胞核排列紧凑.突触膜开始增厚，不对称，以后可形成传入突触.胚胎 50d，毛细胞可分化为型和型，底部出现突触.神经纤维出现于壶腹和囊斑感觉上皮下方，神经纤维开始形成髓鞘.支持细胞减少为 12 层.
14、椭圆囊斑及球囊斑上出现耳石.胚胎 52d 时，成熟突触数量明显增多.本研究观察到豚鼠胚胎 40d 及 50d 前庭终器发育与上述结果相吻合，并在 50d 时观察到毛细胞底部突触已形成，内含大量突触小泡. 目前，对脊椎动物内耳发育的观察已发现凋亡细胞.鸡胚胎第 15 期，耳泡中后部、背部神经发育相关区、内淋巴囊及前庭区出现明显细胞凋亡，并持续一段时间3 .Marovitz 等4 发现大鼠内耳发育中，介于新生耳泡和外胚层之间暂时性连接中含有核固缩细胞;Represa 等6 对人胚胎内耳发育研究中，发现耳凹自外胚层分离形成耳泡期，介于耳泡与外胚层桥形连接也出现凋亡细胞.这一暂时连接消失是由细胞凋亡所
15、引起的.小鼠前庭发育中，大量凋亡细胞出现于胚胎 10.5d，可达到高峰期（14d） ，持续至第 16d.我们对豚鼠胚胎 40d，50d 前庭终器的观察发现，无论壶腹或椭圆囊、球囊斑感觉上皮中，均可见凋亡的毛细胞和支持细胞，并形成凋亡小体.细胞凋亡的形态特征是细胞体积减小，胞膜结构完整，不发生溶酶体裂解，无胞内容物释放，因此不会引起炎症反应，对周围细胞影响小.脊柱动物内耳发育中，从听泡至半规管、中央部前庭及螺旋形耳蜗形成，需要准确三维结构重建.而凋亡可去除任何过度增殖的细胞，是内耳前庭发育的必然过程. 图 1 图 3 略 Marovitz 等7 发现大鼠胚胎耳泡腹侧正中部大量凋亡细胞，而称为“耳
16、坏死区” ，在鸡及人类胚胎同一位置出现同样现象，并能持续一段时间.同时，细胞有丝分裂中心也位于耳泡腹侧正中部5 ，与细胞凋亡区相邻.凋亡细胞发生于此区域的作用机制仍不清楚，也许通过细胞凋亡来限定器官形成的区间区域，或是将一个器官与另一器官相分离.豚鼠胚胎 40d 是内耳前庭上皮增殖期，发生显著的末端有丝分裂，此期毛细胞已分化，数目明显增加，支持细胞数目也有所增多.我们观察到椭圆囊斑凋亡毛细胞下方可见刚发生有丝分裂而新生的支持细胞，进一步证实，细胞凋亡与有丝分裂相邻.凋亡和新生同时存在，过度增殖的细胞通过凋亡途径而消失，自动调节到正常细胞数目，也许与保证器官发育正常形态相关. Zheng 等8
17、运用钙网膜蛋白（可标记分化的毛细胞，包括静纤毛）和 TUNEL 双标技术，首次明确证实正常发育期大鼠前庭终器中分化的毛细胞发生凋亡.我们利用电镜和 TUNEL 技术，通过超微结构观察凋亡细胞结构特点，如染色质皱缩核膜下积聚，细胞连接松解，细胞表面泡状胞质膨隆，可脱落形成凋亡小体;继而胞质内内质网扩大、断裂，线粒体结构完整，进一步证实豚鼠胚胎发育第 40d 及 50d 时，毛细胞可以发生凋亡.现已明确，多种类型神经元细胞在分化时发生凋亡，神经元存活依赖于其突触部位的神经生长因子9 .目前认为，发育期神经细胞生理性死亡是保证神经细胞数目与其靶细胞数目相对应的一个必要过程10 .可推测，在豚鼠内耳前
18、庭终器发育过程中，感觉上皮内毛细胞应与其下方神经纤维的数目保持一致，过度分化的毛细胞可能通过凋亡过程来减少其数目.但这种现象能否使平衡功能更精确，仍需进一步证实. 目前，有关内耳细胞发育的机制尚不清楚，但可以肯定内耳细胞的凋亡与增殖密切相关，并由多种特殊生长因子调控.进一步认识胚胎期内耳细胞凋亡的机理，有利于阐明内耳发育及毛细胞再生修复的机制. 参考文献: 1Alvarez IS，Navascnes J.Shaping，invagination and closure of the chick embryo otic vesicle:Scanning electron microscope a
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