1、四环素人工抗原的合成与鉴定作者：肖理文, 袁耀萍, 郗日沫, 孙秀兰, 王洪新【摘要】 目的: 对牛血清白蛋白进行羧基化和四环素的衍生化, 制备更高偶联比的四环素（TC）-牛血清白蛋白（BSA）偶联物并进行鉴定。方法: 四环素通过两步衍生化后, 形成一种活泼的重氮化中间产物, 与羧基化的 BSA 上的表位羧基反应, 合成 TC-BSA 偶联物。结果: HPLC-MASS 图谱鉴定表明成功的制备了四环素衍生物, 红外及紫外扫描图谱表明, 偶联成功, 计算得偶联比分别为 71 和 111。 结论: BSA 经过羧基化后的偶联效果明显好于未经羧基化的 BSA, 并成功制备了 TC-BSA 人工抗原。
2、 【关键词】 四环素（TC） 羧基化 偶联 人工抗原四环素类抗生素（TCs）是一类由链霉菌产生的宽谱抗生素, 对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌均具有较强的抵抗能力。 因其高效、便宜且能直接通过口服起效的特性, 被广泛应运于禽畜养殖业中, 既能预防治疗疾病, 也能起促进生长的作用。 1998 年, 欧洲动物卫生联盟的一份调查显示, 在欧盟 15 国中, 四环素类抗生素的使用量占了整个禽畜业中抗生素使用量的 651 。 在国内, 四环素类抗生素也同样被大量广泛的用于禽畜养殖业中。 人长期低剂量的摄入四环素类抗生素可能会产生各种慢性和蓄积性疾病, 主要表现在对胃、 肠、 肝脏的损害, 以及牙齿的染色,
3、还会造成过敏反应、 二重感染、 致畸胎等, 同时可能会导致人体肠道中菌群平衡的失调以及耐药性细菌的产生。 为此, 我国规定畜禽肉中四环素的最大残留量不得超过 100 ppb, 禽蛋中不超过 200 ppb2 。 目前, 我国用于检测四环素类抗生素的 ELISA 试剂盒主要靠国外进口, 价格昂贵, 因此急需开发拥有自主知识产权的试剂盒或免疫传感器, 而其关键之一就是制备具有优良免疫原性的四环素完全抗原。 我们通过对载体蛋白 BSA 进行羧基化, 大大提高了其表面活性羧基的数量, 同时对四环素进行衍生化, 获得活泼的重氮化中间产物, 再与 BSA及 sBSA 偶联, 制备四环素完全抗原并对其进行比
4、较。1 材料和方法1.1 材料 UV-2100 紫外扫描仪为北京瑞利公司产品; Nicolet Nexus 傅立叶变换红外光谱仪为美国热电公司产品; WATERS Platform ZMD4000 型高效液相色谱质谱联用仪为美国 WATERS 公司产品; 950 mL/L盐酸四环素标准品(TC.HCl)购于中国药品生物制品检定所; 牛血清白蛋白（BSA）为北京博奥生物技术有限公司 Sigma 公司进口分装; 丁二酸酐（Succinic anhydride） 、 N-氯丁二酰亚胺(NCS)、 水合肼（Hydrazine hydrate）均为美国 Sigma 公司产品; 其他试剂均为分析纯; PB
5、S 缓冲液为 0.01 mol/L, pH7.4, 所用水均为 SZ-97 自动三重纯水蒸馏器制得。1.2 方法1.2.1 BSA 的羧基化(sBSA) 取 20 mL 0.1 mol/L 的 NaCl 溶液, 用 0.1 mol/L 的 NaOH 溶液调 pH 值至 8.0, 冷却至 4, 加入 1 g BSA充分溶解后, 缓慢加入 75 mg 丁二酸酐, 用 3.5 mol/L 的 NaOH 调 pH 值至 8.0, 保持 4磁力搅拌 1 h, 随后于 PBS 缓冲液中透析 3 d, 及时换液, 最后冷冻干燥得粉末状固体, 于-20下保存备用3,4 。1.2.2 TC 半抗原的衍生化与鉴定
6、 TC 在酸碱条件下都比较活泼, 容易形成差向异构化四环素或降解5, 因此通过两步衍生化, 封闭其活性基团, 形成一种活泼的重氮化中间产物, 再与 BSA 偶联。(1)四环素衍生物 4-氧代脱-甲氨基四环素 4, 6-半缩酮（C20H17O9N） （TC1）的合成: 称取 400 mg TC.HCl 标准品, 溶解于 20 mL 超纯水中, 滴加适量0.01 mol/L 的盐酸溶液, 使盐酸四环素充分溶解。 室温条件下, 加入280 mg NCS 粉末,磁力搅拌数分钟后有沉淀析出。 反应 30 min 后, 过滤, 得粗产物, 加入 5 mL 超纯水洗涤, 然后加入 10 mL 乙醚萃取, 放
7、掉下层水相, 反复操作 3 次, 以有效去除杂质。 最后将萃取液置于通风厨中, 自然挥发收集产物, 取少量进行 HPLC-MASS 鉴定6 。 (2)四环素衍生物 4-腙-脱甲基-四环素（C20H19O8N3）(TC2)的合成: 取 220 mg 上步反应所得的 TC1 溶于 15 mL 950 mL/L 的乙醇中, 室温下缓慢加入 50 L水合肼, 立刻析出沉淀 , 磁力搅拌 1 h。 过滤得粗产物, 加入 8 mL 乙醇洗涤, 反复 3 次, 收集产物, 取少量进行 HPLC-MASS 鉴定7 。1.2.3 TC-BSA 和 TC-sBSA 完全抗原的合成与鉴定 取 2 份经过纯化后的 T
8、C2 各 50 mg 溶于 20 mL pH4.7 的超纯水盐酸溶液中, 分别加入250 mg BSA 和 sBSA, 摇匀后缓慢加入 20 mg EDC, 磁力搅拌 1 h, 反应结束后8, 以 PBS 缓冲液为洗脱液, 4下 Sephadex G-25 柱凝胶过滤, 合并 278 nm 处的收集液, 最后冷冻干燥 , 所得粉末保存于-20冰箱中备用9 。对所合成的完全抗原进行紫外分光光度计扫描测定10, 按下式计算偶联物的结合比11 。Ca Cb=ACamKBbm-ACbmKBam ACbmKAam-ACamKAbm式中: Ca /Cb: 偶联物中 A、 B 2 种物质摩尔浓度比(结合比)
9、; ACam, ACbm: 偶联物分别在 A、 B 最大吸收波长下的吸光值; KAam, KBbm: A、 B 在各自最大吸收波长下的摩尔消光系数; KAbm: A 在 B 最大吸收峰波长处的摩尔消光系数; KBam: B 在 A 最大吸收峰波长处的摩尔消光系数12 。2 结果2.1 四环素衍生物 TC1（C20H17O9N）和 TC2（C20H19O8N3）的HPLC-MASS 鉴定 图 1 和图 2 是 TC1 的 HPLC-MASS 谱图, TC1 在液相色谱上的保留时间为 5.23 min, 其余为杂质峰, 通过积分计算其纯度为83.35%; 质谱图中 454 和 438 分别 TC1
10、 与 K+和 Na+的离子峰,计算出相对分子质量（Mr）为 415, 与实际 Mr 相符, 说明 TC1 合成成功。图 3 和图4 为 TC2 HPLC-MASS 谱图, TC2 的保留时间为 9.49 min, 积分得其纯度为52.46%, 杂质较多, 在与载体蛋白偶联前需通过进一步纯化 ; 质谱图中428.1 为其阴离子峰, 计算得其 Mr 为 429, 与实际 Mr 相符, 由此判断, 四环素衍生化合成成功。图 1 TC1 HPLC 图（略）图 2 TC1 质谱图（略）2.2 TC-BSA 和 TC-sBSA 的 HPLC 分析 取透析后 TC-BSA 和 TC-sBSA 做 HPLC
11、分析, 得到图 5 和图 6 的色谱分析图。 图中最高峰的出峰时间分别为 8.960 min 和 8.925 min, 与 BSA 的出峰时间类似, 为 TC-BSA 和 TC-sBSA 偶联物的吸收峰。 但图 5 中左边有 2 个比较突出的吸收峰, 可能为 BSA 在与四环素偶联过程中自身活性氨基与活性羧基相互交联而形成聚合物, 对比图 6, 经过羧基化的 BSA 产生的聚合物明显减少, 偶联物的纯度有所提高。2.3 TC-sBSA 和 TC-BSA 的红外分析 比较 TC-BSA 和 BSA 的红外光谱发现, 它们在 3 6003 200 cm-1 区域以及 1 7001 600 cm-1
12、 区域具有相似的吸收, 这是蛋白质中氨基酸产生的特征峰,说明合成的 TC-BSA 化合物具有 BSA 的特征官能团。将 TC-sBSA 和 TC-BSA 的红外光谱与TC 的红外光谱相比较: 在 TC-sBSA 和 TC-BSA 的红外光谱 947 cm-1 和863 cm-1 处, 出现了 2 个明显的四环素特征峰 , 而 BSA 在此处无明显吸收, 说明 TC-sBSA 和 TC-BSA 具有 TC 的特征官能团的存在, 由此说明TC-sBSA 和 TC-BSA 人工抗原偶联成功, 可以作为免疫抗原。图 3 TC2 HPLC 图（略）图 4 TC2 质谱图（略）图 5 TC-BSA 的 H
13、PLC map 图（略）图 6 TC-sBSA 的 HPLC map 图（略）2.4 TC-BSA 和 TC-sBSA 偶联比计算 图 8 为各样品的紫外扫描吸收光谱分析。分析中所用 TC 的浓度为 50 mg/L, BSA、 TC-BSA 和 TC-sBSA 的浓度均为 500 mg/L。从紫外扫描结果可以看出, 四环素在 274 nm和 362 nm 处有 2 个吸收峰, 与载体蛋白的紫外吸收谱图相比, TC-BSA和 TC-sBSA 发生了明显变化, 出现了四环素的特征吸收峰, 表明半抗原与载体蛋白成功地发生了偶联。 经计算,半抗原与 BSA 的结合比为 71和 111。图 7 TC、
14、BSA 及偶联物红外图谱（略）图 8 TC、 BSA 及偶联物紫外扫描图谱（略）3 讨论牛血清白蛋白表面的赖氨酸 -氨基及末端氨基即表面活性氨基（surface reactive amino group, SRAG）数约为 59 个, 同时也存在约100 个表面活性羧基13 。 通过 BSA 的羧基化, 可以将 BSA 表面的部分活性氨基转变为活性羧基, 增加其亲核反应性的同时也可以有效避免其空间位阻, 提高偶联比4, 而且还可以减少在偶联过程中 BSA 自身氨基与羧基的反应造成的交联, 减少副产物的产生 , 偶联物的 HPLC map图以及偶联比的差异可以证明这点。通过四环素的衍生, 我们制
15、备了偶联比为 71 和 111 的 2 种完全抗原, 初次免疫和 2 次加强免疫新西兰大白兔后, 耳部取血, ELISA 法初步测得针对四环素分子的效价为 18000 和 113000, 因还需进行加强免疫, 最后制备抗体的效价和其他指标另行报道,从该结果也可知, 本研究中合成四环素半抗原及人工抗原的技术路线是可行的, 所得产物与预期相符。【参考文献】1 Bogialli S, Curini R, Corcia AD, et al. Rapid confirmatory method for analyzing tetracycline antibiotics in bovine, swine
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