血液制品病毒灭活因子与动力学的评价.doc

1、血液制品病毒灭活因子与动力学的评价作者：魏宪义，魏红，蹇远勇，陈 海，刘文芳【摘要】 目的 分析血液制品特定灭活因子的时效动力学曲线，科学性地评价与改进不合理的病毒灭活参数。方法 系统性整理针对水疱性口炎病毒、黄热病毒、脊髓灰质炎病毒、伪狂犬病毒、脑心肌炎病毒、人类免疫缺陷病毒，人血白蛋白采用巴氏消毒法，狂犬病人免疫球蛋白采用低 pH 常温孵放法，静注人免疫球蛋白、静注人乙肝免疫球蛋白采用低pH/巴氏消毒法；人纤维蛋白原、人凝血因子采用有机溶剂/去污剂与干热法灭活病毒的验证资料，统计 3 批样品多个取样点的残余病毒滴度均值、标准差与变异系数，制作灭活病毒动力曲线图并进行分析。结果 人血白蛋白巴

2、氏灭活 VSV 与 Sindbis 病毒，HRIG 低 pH 灭活 VSV 和Sindbis 病毒，HRIG 低 pH 灭活 HIV 病毒，IVIG 低 pH/巴氏灭活 HIV 病毒，IVIG 低 pH 灭活 HIV 病毒，HBIG 低 pH/巴氏灭活 VSV、Sindbis 与 Polio病毒。结论 建议改进病毒灭活验证标准与不合理的灭活参数；采用终产品样品通过合适细胞或方法直接培养目标病毒来有效监测血液制品的病毒安全性。 【关键词】 血液制品；病毒灭活；动力学Abstract Objective For the purpose of scientific evaluation and im

3、provement on unreasonable parameter of viral inactivation,the dynamics curve of time corresponding to effect by given viral inactivation factor treated to blood plasma product were analyzed.Methods Aimed at vesicular stomatitis virus, sindbis virus, human immunodeficiency virus, polioviruses, pseudo

4、rabies virus,encephalon-yocarditis virus; validate data of viral inactivated on pasteurization of albumin, human rabies immunoglobulin with pH 4, human immunoglobulin and human hepatitis B immunoglobulin for intravenous injection with pH 4/pasteurization,treatment on human fibrinogen and human coagu

5、lation factor with solvent/detergent and vapor heating at 100 30 min were systemic regularized respectively.The mean and standard deviation also coefficient of variation for virus survival titer in different time were stated, dynamics curve of virus inactivation were made and analyzed.Results Human

6、albumin pasteurization inactivated VSV and Sindbis virus,HRIG low pH inactivated VSV and Sindbis virus,HRIG low pH inactivated HIV virus,IVIG low pH/pasteurization inactivated HIV virus,IVIG low pH inactivated HIV virus,HBIG low pH/pasteurization inactivated VSV,Sindbis and Polio virus.Conclusion Su

7、ggestion about improvement on unreasonable parameter and standard of virus inactivation is made,cultivate target virus directly from final product by appropriate cell or method to monitoring viral safety of blood plasma product is advanced.Key words blood plasma product;viral inactivation;kinetics为了

8、系统性的分析与比较血液制品的病毒灭活方法与效果，科学性的评价与改进不合理的灭活参数，四川远大蜀阳药业有限公司查阅了委托中国药品生物制品检定所与中国人民解放军艾滋病检测实验室对人血白蛋白（检 02 第 731 号） 、狂犬病人免疫球蛋白（检 06 第 1643 号、军第 B06005 号） 、静注人免疫球蛋白（军第 B06002 号、军第 B06003 号） 、静注人乙肝免疫球蛋白（检 06 第 1521 号） 、人纤维蛋白原（检 04 第2720 号）与人凝血因子（检 04 第 2721 号）等 6 类血液制品分别采用巴氏（60 0.5 ，10 h） 、低 pH 孵放（pH 4.10.3,24

9、 1 ，孵放 21 d） 、pH 4.9/巴氏、S/D（0.3%TNBP,1.0%Tween-80；25 1 ；6 h） 、干热（100 、30 min）5 种病毒灭活方法对水疱性口炎病毒、黄热病毒、脊髓灰质炎病毒、伪狂犬病毒、脑心肌炎病毒、人类免疫缺陷病毒 6 个指示病毒的灭活验证报告。单纯的以样品灭活前后病毒下降数量来比较，虽然可以说明病毒灭活效果，但特定因子灭活病毒效率的科学性评价需要时效动力学曲线来衡量。基于这样的理由，本文根据上述病毒验证报告资料，系统地整理、统计与制作了病毒灭活曲线图并进行分析，现将结果报告如下。1 材料与方法1.1 人血白蛋白（human albumin）1.1.

10、1 巴氏灭活病毒条件 60 0.5 ，10 h。1.1.2 样品参数 连续 3 批半成品，蛋白含量：20%，pH 7.0；送检批号：20011134、20011135、20011236。1.1.3 指示病毒、毒液基础滴度 水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus ，VSV,Indiana 株） ，8.25 LgTCID50/ml（半数培养感染剂量，50 tissue culture infective dose,TCID50） ；辛德毕斯病毒（ Sindbis virus，Sindbis） ，7.56 LgPFU/ml（蚀斑形成单位，plaque forming u

11、nit，PFU） 。1.1.4 试验与对照样品 试验样品（巴氏灭活） 、对照样品（70 存放） ；按 91 的比例在样品中加病毒液（273 ml/批）,按1.2 ml/管分装 7 个取样点、重复 2 次的检测样品数量。1.1.5 样品灭活病毒方法与样品取样时间点 留取零时样品后，样品置 59.9 60.3 水浴振摇，在 10 h 观察时间内分 6 次在规定的时间点取样。1.1.6 取样保存 所有样品取样后立即70 冻存备测。1.1.7 滴定方法、最低检测限、培养细胞 VSV：96 孔细胞病变法、0.5 LgTCID50/0.1 ml、VERO 细胞（非洲绿猴肾传代细胞株,african gre

12、en monkey kidney cell line，VERO） ；Sindbis：6 孔盘蚀斑法（结晶紫染色） 、未标注、BHK-21 细胞（幼仓鼠肾细胞，baby hamster kidney,VHK） 。每批样品须至少重复测定 2 次，对病毒滴定阴性的样品盲传三代。1.2 狂犬病人免疫球蛋白（ human rabies immunoglobulin,HRIG）1.2.1 低 pH 孵放灭活病毒条件 pH 3.84.4,23 25 孵放21 d。1.2.2 样品参数 连续生产的三批半成品（低 pH 孵放前） ，蛋白5961 g/L,pH 4.1，4 存放，送检批号：20050703、200

13、51104、20051205。1.2.3 指示病毒、毒液基础滴度 VSV 8.38 LgTCID50/ml；Sindbis 7.24 LgPFU/ml；HIV 8.5 LgTCID50/ml（人类免疫缺陷病毒,human immunodeficiency virus, HIV，B 株） 。1.2.4 试验与对照样品 VSV 与 Sindbis 试验样品（pH 4.1） 、对照样品（按 5.5 ml 酸性样品加 1 mol/L 的 NaOH 0.127 ml 的比例调整至pH 7.0） 。按 91 的比例在样品中加病毒液（364 ml/批）,按 1.2 ml/管分装 5 个取样点、重复 2 次的

14、检测样品数量。HIV 试验样品（样品+毒液） 、阳性对照样品（培养液+毒液） 、阴性对照样品（样品+培养液） 。按 91 的比例在样品（培养液）中加病毒液（培养液） （0.90.1 ml/批）,按 0.1 ml/次分别在 5 个取样点取样。1.2.5 样品灭活病毒方法与样品取样时间点 留取零时样品后，样品置 23 25 孵放 21 d，在观察时间内分 4 次在规定的时间点取样。1.2.6 取样的 pH 调整与保存 所有样品取样后立即调整 pH 至中性，70 冻存备测。1.2.7 滴定方法、最低检测限、培养细胞 参见 1.1.7 项，HIV验证 20050703 重复检测 3 次，MT4 细胞，

15、最低检测限为 2.0 LgTCID50/ml。1.3 静注人免疫球蛋白（human immunoglobulin for intravenous injection,IVIG）1.3.1 低 pH/巴氏灭活 HIV 病毒 病毒灭活方法参见 1.1.1 项, 试验与对照样品参见 1.2.4 项。1.3.2 低 pH 孵放灭活 HIV 病毒 病毒灭活方法参见 1.2.1 项。毒液滴度 8.5 LgTCID50/ml。1.3.3 样品参数 蛋白含量 5%，pH 4.10.3,送检批号：2005122107、2005122108、2005122109。1.4 静注人乙肝免疫球蛋白 （human hep

16、atitis B immunoglobulin for intravenous injection,HBIG）1.4.1 低 pH/巴氏灭活 VSV、Sindbis 与 Polio-1 病毒 病毒灭活方法参见 1.1.1 项。1.4.2 指示病毒、毒液基础滴度 VSV8.38 LgTCID50/ml；Polio-1（脊髓灰质炎病毒,polioviruses Type，Polio-1）9.25 LgTCID50/ml（最低检测限 0.5 LgTCID50/0.1 ml） ；Sindbis 7.24 LgPFU/ml。1.4.3 样品参数 pH 4.9,蛋白质含量 50 g/L,送检批号：2005

17、0602、20050603、20050604。1.5 人纤维蛋白原（human fibrinogen）1.5.1 有机溶剂/去污剂(Solvent/Detergent,S/D） S/D 灭活病毒方法 0.3%TNBP,1.0%Tween-80；25 1 ；6 h。 （1）样品参数：纤维蛋白原（S/D 法前取样、-20 保存） ，蛋白含量 18 g/L、pH 7.0、TNBP 0.3%、Tween-80 1.0%，送检批号：20031020、20031021、20031022。 （2）指示病毒、毒液基础滴度：PRV（伪狂犬病毒,pseudorabies virus，PRV）8.88 LgTCID

18、50/ml；Sindbis 7.64 LgPFU/ml。 （3）试验与对照样品：按试验样品（S/D+病毒） 、对照样品（病毒） 、终止对照样品（S/D+稀释液）的设置与比例分别加 S/D 至 0.3%与 1.0%、病毒液或稀释液（91） ，每批样品的终体积为 10 ml。 （4）样品灭活病毒方法与样品取样时间点：留取1.2 ml 零时样品后，样品置 25 1 水浴振摇，在 6 h 观察时间内分 6 次在规定的时间点取样（终止对照仅取 6 h 样品） 。 （5）取样的稀释、过滤、分装与保存：所有样品取样 1.2 ml,立即用含 4%小牛血清的细胞培养液以 1100 稀释,过滤除菌，分装，70 冻

19、存备测。每批样品须至少重复测定 2 次。 （6）滴定方法、最低检测限、培养细胞：VSV：96 孔细胞病变法、0.5 LgTCID50/0.1 ml、VERO 细胞；Sindbis：6 孔盘蚀斑法（结晶紫染色） 、未标注、BHK-21 细胞。1.5.2 干热灭活病毒方法 100 、30 min。恒温水浴加热。（1）样品参数：纤维蛋白原中间品（20 ml/瓶、-20 保存） ，蛋白含量 18 g/L、pH 7.0、送检批号：20031020、20031021、20031022。每批24 瓶样品试验前 25 水浴融化，按 91 加病毒液后分装（20 ml/瓶） ，每批样品的终体积为 200 ml，7

20、0 冻存，冻干。 （2）指示病毒、毒液基础滴度：PRV 8.62 LgTCID50/ml；Sindbis 7.43 LgPFU/ml；EMCV 7.38 LgTCID50/ml（脑心肌炎病毒，encephalon-yocarditis virus,EMCV） 。 （3）试验与对照样品：试验样品（冻干后加热） 、对照样品（冻干前、后不加热） 。 （4）样品灭活病毒温度与样品取样时间点：留取冻干前、后样品后，样品置 98.8 102.2 水浴恒温加热，在 30 min 观察时间内分 3 次在规定的时间点取样。 （5）取样的保存：所有样品取样后70 冻存备测。每批样品须至少重复测定 2 次。 （6）

21、滴定方法、最低检测限、培养细胞：PRV：96 孔细胞病变法、0.5 LgTCID50/0.1ml、PK-15 细胞（猪肾细胞,pocine kidney cells,PK-15） ；Sindbis：6 孔盘蚀斑法（结晶紫染色） 、未标注、BHK-21 细胞；EMCV:96孔细胞病变法、未标注、VERO 细胞。1.6 人凝血因子（human coagulation factor ）1.6.1 S/D 灭活病毒方法 病毒灭活方法参见 1.5.1 项。样品参数：凝血因子（S/D 法前取样、-20 保存） ，蛋白含量 16 g/L、pH 7.0、TNBP 0.3%、Tween-80 1.0%，送检批号

22、：20031001、20031002、20031003。指示病毒、毒液基础滴度：PRV 9.12 LgTCID50/ml；Sindbis 7.34 LgPFU/ml。1.6.2 干热灭活病毒方法 病毒灭活方法参见 1.5.2 项。样品参数：凝血因子（10 ml/瓶，冻干品） ，蛋白含量 16 g/L、pH 7.0、TNBP 0.3%、Tween-80 1.0%，送检批号：20031001、20031002、20031003。指示病毒、毒液基础滴度：PRV 8.26 LgTCID50/ml；Sindbis 7.28 LgPFU/ml；EMCV 7.38 LgTCID50/ml。1.7 病毒滴度计

23、算方法 按 Karber 法计算1 。1.8 数据统计与灭活病毒动力曲线图 使用 Casio 计算器统计以上 3 批样品 7 个取样点的残余病毒滴度均值、标准差与各取样时间点合并的变异系数（coefficient of variation,CV） ，采用电脑 Office 程序、Excel 2003 图表软件制作灭活病毒动力曲线图，3 批间病毒残余数量变异系数5%时,距病毒滴定阴性时限终端2 个安全系数设置病毒灭活工艺时限（technical time limit of virus inactivation,TTI） 。2 结果2.1 人血白蛋白巴氏灭活 VSV 与 Sindbis 病毒 见图

24、 1。图 1 白蛋白巴氏灭活病毒动力曲线从图 1 可看出，在 1 h 内，白蛋白残存 VSV 与 Sindbis 病毒很快降低至最低检测限，CV 分别是 2.9%、2%，TTI 分别是 1 h、2 h,灭活病毒的数量6 Log,说明该方法灭活病毒效果佳。2.2 HRIG 低 pH 灭活 VSV 与 Sindbis 病毒 见图 2。从图 2 可看出，在 21 d 内，在 pH 7.0 时，HRIG 残存 VSV 下降 1.66 Log（6.24.54）, 在 pH 4.0 时，HRIG 残存 VSV 与 Sindbis 病毒缓慢降低至最低检测限，灭活病毒的数量6 Log, CV 分别是 3.27

25、%、3%，TTI分别是 14 d、28 d,说明该方法灭活病毒效果较好。2.3 HRIG 低 pH 灭活 HIV 病毒 见图 3。图 3 HRIG 低 pH 灭活HIV 动力曲线从图 3 可看出，在 21 d 内，在 pH 7.0 时,HRIG 残存 HIV 下降3.94 Log（8.334.39）, 在 pH 4.0 时 HRIG 残存 HIV 缓慢降低至最低检测限，灭活病毒的数量6 Log,CV 是 3.8%，TTI 是 14 d,说明就 HRIG 而言， pH 4.0 与 pH 7.0 对 HIV 的存活时间虽然存在差异但意义不大，HIV对特定环境抵抗力很差。2.4 IVIG 低 pH/

26、巴氏灭活 HIV 病毒 见图 4。图 4 IVIG 低 pH/巴氏灭活 HIV 动力曲线从图 4 可看出，在 4 h 内，IVIG 残存 HIV 病毒降低至最低检测限，灭活病毒的数量6 Log, CV 是 0，TTI 是 8 h,说明该方法灭活病毒效果很好。与-70 对照样品比较 HIV 对热因子非常敏感。2.5 IVIG 低 pH 灭活 HIV 病毒 见图 5。图 5 IVIG 低 pH 灭活 HIV 动力曲张（d）从图 5 看出，在 21 d 内，在 pH 7.0 时 IVIG 残存 HIV 下降 3.94 Log（8.334.39）, 在 pH 4.0 时 IVIG 残存 HIV 缓慢降

27、低至最低检测限，灭活病毒的数量6 Log。CV 分别是 3.7%、3.1%，TTI 分别是 14 d、28 d,说明就 IVIG 而言， pH 4.0 与 pH 7.0 对 HIV 的存活时间虽然存在差异，但意义不大，HIV 对特定环境抵抗力很差。2.6 HBIG 低 pH/巴氏灭活 VSV、Sindbis 与 Polio 病毒 见图 6。图 6 HBIG 低 pH/巴氏灭活病毒动力曲线从图 6 可看出，在 0.5 h 内，HBIG 残存 VSV、Sindbis 与 Polio 病毒降低至最低检测限，灭活病毒的数量6 Log, CV 分别是 4.3%、3.6%与 3.6%，TTI 分别是 0.5 h、1 h 与 1 h,说明该方法灭活病毒效果很好（与图 1 与图 4 的结果相似） 。2.7 纤维蛋白原 S/D 灭活 PRV、Sindbis 病毒 见图 7。图 7 纤维蛋白原 S/D 灭活病毒动力曲张