1、脂质体携载 ATP 对顿抑心肌的保护作用作者：李伟杰 贾国良 郭文怡 刘兵 【关键词】 心肌顿抑 关键词: 心肌顿抑;脂质体;三磷酸腺苷 摘 要:目的 观察恢复顿抑心肌的能量代谢对其功能的影响. 方法 在 18 只麻醉开胸犬上建立局部心肌顿抑（My-ocardium Stunning）模型，在顿抑心肌局部灌注脂质体包裹的三磷酸腺苷（ATP） ，用高效液相色谱法测量心肌腺苷酸含量.动态监测血流动力学及局部心肌收缩力的变化. 结果 冠脉灌注脂质体携载 ATP 可以明显提高心肌细胞 ATP 含量，减少顿抑局部血清丙二醛的产生，降低心肌细胞 Ca2+ 含量，提高局部心肌收缩力，加快心脏收缩功能的恢复.
2、而冠脉灌注游离 ATP 则无此作用. 结论 顿抑心肌能量代谢与心功能之间有着密切联系，提高顿抑心肌 ATP 含量可以加快心功能的恢复.脂质体作为载体可以将外源性 ATP 导入心肌细胞内，是一种很有前途的治疗措施. Keywords:Myocardium stunning;liposome;ATP Abstract:AIM To test whether restoration of adenosine triphosphate（ATP）levels in myocytes after brief coronary artery occlusion might improve the funct
3、ion of postischemic myocardium.METHODS Eighteen anesthetized，ventilated dogs underwent thoracotomy.A silastic perfusion shunt was established between the left carotid and proximal LAD arter-ies.Then the dogs were subjected to15min of LAD occlu-sion and60min of reperfusion.ATP-liposome（n=6，2.5mmolmin
4、-1 ） ，free ATP（n=6，2.5mmolmin -1 ）or an equivalent volume of saline（control，n=6）was injected into the proximal LAD respectively during the reperfusion.The adenine nucleotide content of myocardium was studied with high-performance liquid chromatography.Regional myocar-dial contractility was measured
5、with a myocardial tension transducer.RESULTS ATP-liposome increased the ATP content of postischemic myocardium significantly （2.490.23）mmolg-1 vs control（1.900.21）mmolg-1 ， P0.01 ，decreased myocyte calcium （1.820.27）mmolg-1 vs control（2.210.20）mmolg-1 ，P0.05and mal-ondialdehyde content of serum and
6、improved the regional my-ocardial contractility，while free ATP failed to do so.CONCLUSION Restoration of ATP levels in stunned my-ocardium may improve the contractility of the heart.Lipo-some-entrapped ATP infusion into the stunned myocardium can increase myocardial ATP content，and may be a benefici
7、al therapy. 0 引言 随着急性心肌梗死溶栓治疗及经皮冠状动脉腔内成形术等心脏介入性治疗和心脏外科手术的广泛开展，心肌顿抑（Myocardium Stunning）现象已引起国内外学者的极大关注1，2 ，对其发生机制及防治方面进行了大量的实验和临床研究.能量代谢在心肌顿抑发生中的作用一直是研究的一个热点.研究发现，顿抑心肌三磷酸腺苷（ATP）含量下降需数小时或数日才能恢复正常，与心功能的恢复相一致3 .我们首次采用脂质体携载 ATP 加快心肌 ATP 含量的恢复，观察其对顿抑心肌功能和生化的影响. 1 材料和方法 1.1 ATP 脂质体的制备 采用改良的逆相蒸发法4 ，按分子比为55
8、1 称取卵磷脂、胆固醇和十八胺，共溶于乙醚中，加入含 ATP 的0.05molL-1 的 PBS，逆相蒸发成膜，超声震荡制备出直径80100nm、均匀稳定带正电荷的 ATP 脂质体.包裹率测量:采用透析法分离出游离 ATP.将透析后的脂质体乳浊液按 101 比例加入50mLL-1 Trston X-100 振荡，待完全透明后用高效液相色谱法测量 ATP 含量.本实验测量包裹率为 35%. 1.2 动物模型建立 健康成年杂种犬（由第四军医大学实验动物中心提供） ，雌雄不拘.以戊巴比妥钠麻醉后开胸，做一心包床，分离心大静脉插入 Y 形胶管，连通右心房，建立静脉回流和供采血用.于冠脉左前降支第一对角
9、支远端分离冠脉，行颈动脉-左前降支旁路术:将外径 3mm的薄壁塑料管插入左颈总动脉，另一端与插入左前降支远端的塑料管相连，中间串入三通开关，通过旁路三通开关，造成冠脉关闭及开放，并经此冠脉内给药.经股动脉插管测量左室压及动脉压，在左前降支第二对角支下插入肌张力传感器（XH-1 型）缝线固定在心外膜上，张力变化由八导生理仪（RM-6000）记录.同步记录左心室压力图形.测量收缩末和舒张末心肌张力差，以缺血前为基点，计算缺血后及再灌注各时间点的心肌张力变化，以百分比表示. 1.3 心肌能量物质的测量 实验结束后迅速将犬处死，立即取左室缺血再灌区和非缺血区全层组织各一块，置于液氮中速冻，后切取约0.
10、5g 心肌组织，准确称质量，置于预冷的玻璃匀浆器中，按 110 的比例加入预冷的 0.6molL-1 HClO4 ，在冰浴条件下制成心肌匀浆，在-4冰箱内放置 24h 后，低温 4000rmin-1 离心 15min，取上清液，在 0条件下，用 5molL-1 KOH 滴定调节 pH 值为 7.0，低温 4000rmin-1 离心 15min，取上清置于冻存管内-40冻存待测.测量前取出标本，室温融化后立即检测.测量采用 HPLC 法，每份标本测量 4 次，取平均值. 1.4 心肌 Ca2+ ，Mg2+ 含量 采用常规火焰吸收法测定. 1.5 血清丙二醛（MDA）测量 用改良八木国夫法. 1.
11、6 实验分组 阻断冠脉 15min，再灌注 60min，于再灌同时冠脉灌注药物 55min.动物随机分为 3 个组:顿抑对照组（CON，n=6）冠脉灌注生理盐水;游离 ATP 组（LAA，n=6）冠脉灌注空白脂质体加ATP2.5molmin-1 ;ATP 脂质体组（LEA，n=6）冠脉灌注脂质体包裹 ATP2.5molmin-1 .统计学处理:数据用 x s 表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对 t 检验. 2 结果 2.1 血流动力学及局部心肌收缩力变化 心率（HR） 、平均动脉压（MAP）和左室收缩压在缺血及再灌注过程中，有缓慢下降趋势，各组之间无显著差异.dp/dtma
12、x 在缺血后下降，再灌注后逐渐恢复，3 组间比较无显著差异.LEA 组+dp/dtmax 在再灌注 15min 后与缺血前无差异，较LAA 和 CON 组恢复提前，左室舒张末压各组间无显著差异.局部心肌收缩力在缺血及再灌注过程中明显低于缺血前水平（P0.01） ，LAA 组对局部心肌收缩力的影响与 CON 组比较无显著差异，LEA 组使局部心肌收缩力增强，与 CON 组比较 P0.01（Tab1）. 表 1 犬心肌局部收缩力变化 略 表 2 再灌注 60min 犬心肌核苷酸含量 略 2.2 心肌腺嘌呤核苷酸含量变化 顿抑组冠脉阻断 15min 再灌注60min 时心肌 ATP 含量为正常区的
13、63%，LEA 组 ATP 含量为正常区的79%，较 CON 组明显升高，LAA 组 ATP 含量与 CON 组比较无显著差异（Tab2）. 2.3 顿抑局部血清 MDA 含量变化 CON 组缺血 15min 及再灌注过程中血清 MDA 含量升高，LEA 组再灌注过程中血清 MDA 含量明显低于 CON 组，而 LAA 组与 CON 组间无差异（Tab3）. 表 3 犬心大静脉血清 MDA 含量 略 2.4 心肌 Ca2+ 和 Mg2+ 含量变化 CON 组再灌注 60min 时心肌 Ca2+ 明显高于正常区（P0.05） ，LEA 组心肌 Ca2+ 低于 CON 组（P0.01） ，LEA
14、组心肌 Mg2+ 含量高于 CON 组，但未达到统计学意义.而LAA 组心肌 Ca2+ ，Mg2+ 与 CON 组比较无明显差异（Tab4）. 表 4 犬顿抑区心肌钙离子和镁离子含量 略 3 讨论 能量是维持细胞结构完整性和心肌收缩功能的基础.心肌顿抑时 ATP含量的恢复和结构损伤的恢复及心功能的恢复相平行，三者之间有着一定的内在联系.心肌线粒体功能下降，能量产生障碍，导致 ATP 含量的低下，是心功能低下的一个原因.纠正心肌能量代谢可使其功能得到改善5 .又有研究发现心肌 ATP 含量与心功能的高低并不直接相关6 .补充外源性 ATP，直接提高心肌 ATP 含量是研究能量与心功能之间关系最直
15、接的方法，但由于 ATP 是一种大分子化合物，正常情况下难以通过细胞膜进入细胞内，其作用主要是通过作用于细胞表面的受体或降解为腺苷而发挥的.脂质体是用人工方法制备的，由磷脂双分子层薄膜形成的微球体，它可以将药物包封于其囊内的水相内.它可通过融合、胞饮等方式，将药物带入细胞内，改变原来药物的代谢、清除和排泄过程，提高了药物在靶组织中的分布.研究发现缺氧心肌和去极化心肌细胞摄取带正电荷脂质体增加，特别是缺血再灌注区心肌摄取脂质体能力最强7 .故脂质体是一种较理想的载体被用来携载药物及生物活性物质治疗心肌缺血 8，9 .本实验采用脂质体将外源性 ATP 导入心肌细胞内，改变了其作用方式和代谢，使其药
16、理作用发生了变化.本实验结果显示脂质体包裹ATP，提高了心肌细胞 ATP 含量，使再灌注 60min 时 ATP 含量升高到正常的 79%，明显高于对照组.心肌腺嘌呤核苷酸总量较对照组和空白脂质体加 ATP 组升高，这为心肌线粒体再磷酸化提供了基础.能量负荷（EC）是反映心肌再磷酸化能力的一个指标，缺血及再灌注过程中 EC 较正常区显著下降，而脂质体包裹 ATP 可以提高顿抑心肌能量负荷，提示顿抑心肌再磷酸化能力增加，ATP 产生增加.本实验结果还显示脂质体携载 ATP 减少了氧自由基的产生和脂质过氧化的发生，减轻细胞内钙超载，使再灌注损伤减轻.同时使心肌收缩力增加，心脏收缩功能恢复加快.当然
17、，顿抑心肌是一个多因素参与的复杂病理过程，如有研究表明乙醇通过 ATP依赖的 K 通道以外途径促进顿抑心肌收缩功能恢复10 .本研究提示，顿抑心肌能量代谢与功能之间有着密切联系，提高心肌 ATP 含量可以加快心功能恢复，脂质体可以外源性 ATP 导入心肌细胞内，可能会有良好的应用前景. 参考文献: 1Rinaldi CA，Hall RJ.Myocardial stunning and hibernation in clinical practice J.Int J Clin Pract，2000;54（10）:659-664. 2Grubitzsch H，Ansorge K，Wollert H
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