1、重金属镉离子人工合成抗原的荧光特性分析【摘要】 以 1(4 异硫氰苄基)乙烯基二胺N,N,N,N 四乙酸为双功能螯合剂，偶联 Cd2+与血清蛋白质分子, 合成了 Cd2+人工抗原。利用荧光光谱分析了 Cd2+人工合成抗原的荧光特性并得到合成反应的偶联比为 111161；通过荧光相图分析表明, Cd2+人工抗原合成过程中血清蛋白质的折叠状态符合“二态模型” ；偏振荧光光谱检测结果显示, Cd2+人工抗原合成中血清蛋白质色氨酸残基的微区构象发生一定变化，导致载体蛋白质构象改变。 【关键词】 镉, 人工抗原, 荧光分光光度法Detection of Artifical Antigen for Cd
2、by luorescence SpectrometryGUO Ming, PANG ShuoQuan, ZHANG LuYingDepartment of Chemistry, Zhejiang Forestry University, Linan 311300Abstract Artificial antigen CdIEDTABSA (HSA) was successfully synthesized by the bifunctional chelating agent IEDTA (isothiocyanobenzylethyl enediamine tetraacetic acid)
3、 coupling with cadmium and protein carrier. The fluorescence characteristics of antigen were determined by fluorescence spectrophotometry and the coupling ratio 111161 was obtained for the coupling reaction. The folding status of serum albumin during the synthesis process of artificial antigen CdIED
4、TABSA (HSA) was analyzed using “fluorescence phase diagram”, and the result shows that it was conformed to the “allornone” pattern. The polarization fluorescence spectra show that the microenvironments of tryptophan residues in carrier protein have some changes to cause changes in protein conformati
5、on.Keywords Cadmium, artificial antigen, fluorescence spectrophotometry1 引 言持久污染物重金属镉对人类健康危害极大，镉的残留检测在环境、食品安全等领域已引起广泛关注。免疫分析检测是近年发展起来的速测新技术，已大量应用在有机污染物残留检测领域13，重金属免疫分析是研究的新方向。重金属免疫分析技术的核心为抗体的制备，而人工抗原的成功合成又是获得抗体制备的关键，故建立重金属人工合成抗原的检测、表征手段具有重要意义。目前，荧光分光光度法对重金属人工合成抗原的检测报道甚少，重金属镉离子人工合成抗原荧光特性分析可为重金属人工抗原的检
6、测提供参考。2 实验部分2.1 仪器与试剂F4500 荧光分光光度计，AA6650 原子吸收分光光度计，UV2550 紫外分光光度计(日本岛津公司)；BS224S 电子分析天平(十万分之一, Sartorius 公司)；ZD2 自动电位滴定(上海雷磁公司)；德国赛多利斯超滤管(6 mL, 北京泽平科技有限公司)。牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA） （Sigma 公司)；1(4 异硫氰苄基)乙烯基二胺N,N,N,N 四乙酸(IEDTA，Dojindo 公司)；Cd 单元素物质标准溶液(国家标准物质研究中心)；实验用水均为二次蒸馏水；其它试剂均为分析纯。2.2 Cd2+人工抗原的合成称
7、取 IEDTA 0.8 mg，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解并定容至 2 mL，加入 0.4 mg CdCl2，反应 30 min。将 2.5 g/L BSA 缓慢加入到 IEDTA 和CdCl2 的混合溶液中，搅拌 20 min，于 4 下存放 12 h，将混合液用分子量为 30 kD 的超滤管超滤（TrisHCl 不断冲洗）除去未反应的小分子物质，用 TrisHCl 稀释至 5 mL，20 冰箱保存产物。以 HSA 为载体蛋白质，按同样方法合成另一种 Cd2+人工抗原 CdIEDTAHSA 。2.3 荧光光度法测定 Cd2+人工合成抗原用 TrisHCl 缓冲液将载体蛋白质(HS和 BSA)
8、和相应的人工抗原配制成一定浓度的溶液，激发波长 295 nm,在（300.1）下绘制250550 nm 发射光谱；读取荧光强度并根据相关原理制作荧光相图；在同样条件下，采集偏振荧光光谱数据并根据公式定量计算偏振度和各向异性。3 结果与讨论3.1 Cd2+人工抗原的合成利用 IEDTA 分子上具有的 EDTA 子结构与 Cd2+形成稳定的六齿配体螯合物，同时通过其活泼的异硫氰根与载体蛋白质分子结合形成CdIEDTA 蛋白质复合物。其反应原理见图解 1。定量 Cd2+与过量螯合剂反应，未反应的 Cd2+在碱性条件下生成沉淀，则仅有 CdIEDTA 与蛋白质发生反应。同时过量 CdIEDTA 可与载
9、体蛋白质充分反应从而减少合成人工抗原中载体蛋白质含量。合成的Cd2+人工抗原不被超滤管滤过，不仅在光谱分析中表现出异于载体蛋白质分子的特征，而且在原子吸收分析中含有 Cd2+信号，证明 Cd2+人工抗原合成成功。3.2 荧光分光光度法检测结果3.2.1 合成 Cd2+人工抗原的荧光光谱 载体蛋白质是一种内源性荧光物质，偶联后人工抗原中的半抗原分子将影响载体蛋白质的荧光发射强度。据此可以判断人工抗原合成中蛋白质是否偶联成功及偶联程度的强弱4。从图和图可见，BSA 和HSA 在 343 nm 处有强的荧光发射峰，CdIEDTA 在 295 nm 激发光下，没有出现发射光谱，而同浓度的 Cd2+人工
10、合成抗原在 343 nm 处的荧光强度呈规律性减弱，这说明 Cd2+人工抗原合成中半抗原分子可能与有荧光特性的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸发生了相互作用，或者与其相近邻基团发生了反应，从而导致其载体蛋白质分子的荧光特征改变。表 1 和表 2 为根据两种合成 Cd2+人工抗原特征光谱提取的荧光强度数据及定量计算结果。其中是载体蛋白质荧光强度，F是镉离子人工抗原的荧光强度，F=FF为荧光强度减弱值，f=F/F= FF/F 荧光强度减弱比率，由此求得 CdIEDTABSA 荧光强度的平均减弱率为 50%左右，而 CdIEDTAHSA 的平均减弱率为 44%。可见，Cd2+人工抗原合成中，相同半抗原分子对
11、不同载体蛋白质内源荧光强度的影响不同，说明载体蛋白质分子结构的改变程度有差异。3.2.2 Cd2+人工抗原合成对载体蛋白质二级折叠结构的影响 荧光相图法可以直观地获得蛋白质折叠结构的变化信息，其原理是将发射波长分别为 1 和 2 时，蛋白质折叠结构发生变化时所测得的相应荧光强度 I(1)对 I(2)作图（荧光相图） ，据此分析蛋白质结构变化程度的方法，。若蛋白质去折叠过程符合“二态模型” ，则荧光相图表现为一条直线；若蛋白质去折叠是一个序变过程，即符合“多态模型” ，则荧光相图分别表现为两条或多条直线。一般地，1 和2 可以是荧光发射谱上任意波长，但是分别取处于荧光发射峰两个斜面上不同波长所获
12、取的荧光相图更准确，并能提供更多的结构变化信息。CCdIEDTABSA, CCdIEDTAHAS 对应于图 2 和图 3 （corresponding to Figs.2 and 3）本工作通过荧光相图分析不同浓度Cd2+人工抗原中半抗原分子对载体蛋白质二级折叠结构的影响，实验取多组波长下的荧光强度作图并比较相关系数，得出 I320I365 的相图最精确。由荧光相图(图)可见，不同浓度 Cd2+人工合成抗原的荧光相图为线性关系，说明合成过程中 Cd2+诱导血清蛋白质的折叠变化过程符合典型的“二态模型” 。3.2.3 合成 Cd2+人工抗原的偏振荧光光谱 偏振荧光光谱反映的是荧光体分子在激发波长
13、下发射波长变化的偏振光谱。偏振荧光光谱可用偏振度 P 与各向异性 r 来度量并可以根据文献公式计算。实验表明，BSA/HSA 的偏振荧光光谱图表现为色氨酸残基的荧光，故可从偏振荧光光谱图的角度研究载体蛋白质偶联半抗原分子后 Cd2+人工抗原分子中色氨酸残基的构象变化。分别测定 Cd2+人工抗原、载体蛋白质的偏振荧光光谱并读取相应的偏振数据，进而计算荧光偏振度(P)及各向异性(r)，结：计算值和 r 值的校正因子(carrect factor for cacutating P and r).果列于表 3。表 3 Cd2+人工合成抗原偏振荧光的偏振度(P)及各向异性(r)值（略）由表 3 可见，当
14、半抗原分子偶联载体蛋白质生成 Cd2+人工抗原分子后，荧光体的体积变大，转动速度变慢，则 CdIEDTABSA 和CdIEDTAHSA 的偏振度及各向异性均有提高，这一现象说明 Cd2+人工抗原分子的生成使载体蛋白质分子中色氨酸残基的微区构象发生了变化，色氨酸残基微区构象的改变直接导致了载体蛋白质分子构象一定程度的改变。同时，从表 3 数据可见，载体蛋白质分子不同，P 及 r 值有一定的差异，表明载体蛋白质分子的结构差别可能会导致所生成的结合复合荧光体分子状态的差别，这说明偏振荧光光谱也能提供同一半抗原分子偶联不同载体蛋白质分子形成荧光物质在不同环境下的指纹信息，极大丰富了荧光光谱的选择性及灵
15、敏性。3.3 原子吸收检测结果配制 Cd2+标液系列溶液，在 AAS 上作标准曲线，分别取两种 Cd2+人工合成抗原 1 mL，稀释 25 倍后用 AAS 检测 Cd2+的含量。经 AAS 检测，人工抗原 CdIEDTABSA 和 CdIEDTAHSA 中的 Cd2+含量分别为 20.0及 26.0 mg/L，此结果说明 Cd2+人工抗原合成成功。偶联比计算公式：=CdVma bV mb=CamaCbmb (1)式中， 为偶联比；Ca 为镉离子的浓度；Cb 为反应前蛋白质的浓度；V 为反应后溶液体积；ma、mb 分别为镉和载体蛋白质的平均分子量。计算 CdIEDTABSA 和CdIEDTAHS
16、A 的偶联比分别为 111121 和 141151。3.4 紫外光谱分析用 BCA 试剂盒测定 Cd2+人工抗原中蛋白质浓度，以 TrisHCl 缓冲液为空白对照，将 CdIEDTA 、BSA、HSA 以及合成的 Cd2+人工抗原用TrisHCl 缓冲液配成一定浓度的溶液，用紫外分光光度计扫描。UV 图谱见图，BSA 的特征吸收峰在 278 nm 附近，CdIEDTA 的最大吸收峰在 266 nm 附近，偶联后的产物在 260280 nm 波长范围内，波形趋于平缓，同时具备了半抗原和载体蛋白质的吸收特性。同样，HSA 及其偶联物也具有此特性，从这些结果可以间接证明偶联成功。经检测半抗原(Ch)
17、的浓度为 0.01 g/L，载体蛋白质(Cp)和人工抗原(Ca)的浓度为 0.3 g/L，偶联比按如下公式推算：=(Aa266Kp278 Aa278Kp266)/(Aa278Kh266 Aa266Kh278) (2)其中，Aa266 是人工抗原在 266 nm 处的吸光度，Aa278 是人工抗原在 278 nm 出的吸光度。Kp278 、Kp266 、Kh266 、Kh278 分别为载体蛋白质和半抗原分子在 266 和 278 nm 处的摩尔吸光系数。根据公式(2)计算人工抗原CdIEDTABSA 和 CdIEDTAHSA 分子中半抗原与载体蛋白质的偶联比分别为 111 和 161。3.5 结
18、论采用荧光光谱方法表征 Cd2+人工合成抗原，以偶联前后半抗原分子及载体蛋白质荧光强度的变化规律为依据，通过荧光相图及偏振荧光光谱测定了 Cd2+人工抗原合成中半抗原分子对血清蛋白质二级折叠结构及分子构象的影响，并结合 UV 与 AAS 方法检测 Cd2+人工抗原合成结果。几种检测方法相互印证并一致表明 Cd2+人工抗原合成成功，偶联比在111161 之间（凝胶电泳实验显示同样结果，限于篇幅文中未列出相关数据及 SDSPAGE 泳带图） 。与常规方法对比，荧光光谱方法具有简便、快速的特点，可以作为初步合成人工抗原的定性检测指标之一。【参考文献】1 Ferguson B S, Kelsey D
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