1、真菌感染现状与对策,梅河口市新华医院,真菌感染发生率急剧上升原因,低免疫人群上升检测技术的提高和发展,内 容,真菌感染现状临床感染现状真菌耐药现状实验室对策1真菌耐药监测提供经验用药依据2传统检测和非培养方法结合争取最佳治疗时间3鉴定菌株到种4告诉医生如何应用真菌药敏结果SFI诊断和治疗策赂,当前真菌感染的特点,曲霉菌感染上升非白念感染上升白色念珠菌感染为主（50-60%）某些真菌生前不易出现阳性,据WHO统计，能引起人类疾病的真菌约有 270 余种，尤其是深部真菌，可侵袭心、肺、血液、胃肠等人体各个器官和系统。真菌感染已成为临床感染学中不可忽略的一部分。,念珠菌属已成为重症监护病房（ICU）
2、病人中最常见的致病菌中的第四位。1995年，欧洲重症监护感染流行学会（EPIC）调查报告分析了1992年在14个欧洲国家1417个ICU病房在一天之内44.8接受抗感染治疗的病人中有17.1的患者的感染是与真菌有关。,美国医院内感染监测系统的统计资料,1992-1993年与1980-1982年相比念珠菌的发病率由百万分之2.6增至72.8 、隐球菌病由4.0增至65.5、曲霉菌8.4增至12.4,占所有病原感染患者上升率的首位。,美国 1997年真菌感染由1980年的第10位上升到第7位,死亡率上升3.9倍侵袭性真菌感染死亡率达76%,近年来我国院内SFI发病率也日趋增高,中华医学杂志2003
3、年3月第83卷第5期,真菌感染总例数149人，其中134例为系统性真菌感染，最后5年75例均为系统性真菌感染,不同基础疾患下侵袭性曲霉病的发病率,基础疾患 发病率范围 (%)肺 心脏移植 19-26肝移植1.5-10肾移植0.5-10异基因造血干细胞移植4-9自体造血干细胞移植0.5-6,Denning Clin Infect Dis 2001 26 pp781-805,真菌血症菌类分布,深部真菌感染的死亡率,隐球菌病：不能及时诊断和治疗 86%一年内死亡 92%在二年内死亡器官移植死亡原因 90%由于曲霉菌感染 不能及时确诊。 念珠菌病死率达40%、侵袭性曲霉菌病可高达50-100%。,30
4、1医院尸检报告,1977-1997肺真菌感染3.7%(38/1027),局限性感染7.8%,播散性92.2%,曲菌34.2%,白念26.3%,新型隐球菌13.2%,孢子丝菌和毛霉菌各3.8%,复合真菌感染21%。,真菌感染死亡率高的原因,尸体解剖发现 50%播散性真菌感染血培养阴性 缺乏敏感的检测指标患者无特异的临床症状真菌培养报告太慢患者由此失去最佳的治疗时间,北京医院992株念珠菌对4种抗真菌药的敏感性%(ATB-Fungus-2),内 容,真菌感染现状临床感染现状真菌耐药现状实验室对策1.真菌耐药监测提供经验用药依据2.传统检测方法3非培养方法争取最佳治疗时间SFI诊断和治疗策赂,对 策
5、,耐药监测提供经验用药依据传统检测非培养方法快速报告，抓住最佳的治疗时机尽最大努力鉴定到种药敏结果存在局限性正确解读实验室报告,全球多中心真菌体外敏感性监测,以美国衣阿华(IOWA)大学为中心38个国家和地区99个研究室参加了“全球抗真菌耐药监测”研究 （1997-2005年）纸片扩散法：只有氟康唑和伏立康唑,国家和地区,欧美国家：美国(10)、英国(9)、德国(4)、意大利(8)、俄罗斯(9)等亚洲国家中国(5)、新加坡(1)、日本(1)、韩国(2)、马来西亚(1)等非洲国家南非(7)、厄瓜多尔(2)等中东国家沙特阿拉伯(1)、以色列(1)等,国外ARTEMIS,2000年以前33个国家62
6、个研究中心2001年35个国家89个研究中心2002年36个国家111个研究中心2003年39个国家128个研究中心,国内ARTEMIS参加单位,1998-2002年北京协和医院检验科上海中山医院临床微生物中心2003年上海华山医院抗生素研究所广州呼吸病研究所检验科浙江大学第一附属医院感染科,酵母菌种类变化,九十年代最引人注目的是酵母菌种类发生了明显的变化，白念珠菌比例减少，上升的：菌名 85-92年 () 96-2002年(%)白念珠菌80-9043-75热带念珠菌10-1310-15近平滑念珠菌 1-614-21光滑念珠菌 3-412-24克柔念珠菌 1 5-27葡萄芽念珠菌 12-5新型
7、隐球菌 11-5,前10位的酵母菌对氟康唑的敏感性,菌名 株数SSDDR%白念珠菌 3883398.40.70.8近平滑念珠菌 262893.84.41.8 热带念珠菌 299092.54.92.6葡萄芽念珠菌 27493.43.33.3新型隐球菌68889.14.86.1念珠菌属258381.210.78.1季也蒙念珠菌36578.612.98.5其它念珠菌115875.311.313.4光滑念珠菌561165.520.114.4克柔念珠菌1206 17.731.150.7,1997-2005主要酵母样真菌分离率（ARTEMIS）,主要念珠菌对氟康唑的耐药率%,1997-2005光滑和克柔对
8、氟康唑的耐药性%,邹折假丝酵母在全球的分离率%,邹折假丝酵母对氟康唑和伏立康唑的耐药率%,季也蒙假丝酵母在全球的分离率%,不同病区季也蒙假丝酵母对氟康唑和伏立康唑的敏感率%,中国5家医院1998年-2003年临床分离菌种分布比较,百分比（）,真菌,2003年中国5家医院酵母菌属真菌对氟康唑的敏感率（）,百分比（）,真菌,中国5家医院伏立康唑对1009株酵母菌属真菌的抗菌活性(mg/L),目前常用的酵母鉴定程序,酵母种的鉴定以生理，生化特征为主，真菌的形态为辅。传统的方法是碳源的发酵和同化。目前已普遍采用API20c Aux 试剂盒及VITEK(自动微生物分析仪) ，可鉴定40余种酵母。,标本接
9、种于含氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂及显色培养基，分别置25C及37C培养48小时，常见的酵母在显色培养基即可报告，鉴定的符合率在95左右。,深部标本（痰、粪、尿、脓、体液、咽拭、尿道及阴道分泌物）,念珠菌显色培养基,原理：几种常见念珠菌独特的酶底物与显色基团化学结合既可用于检测，又可根据菌落颜色用于鉴定95%以上的白念珠菌（绿、翠绿或兰色）、热带念珠菌（蓝或粉红色）、克柔念珠菌（粉红，模糊有微毛或白色）， 85%的光滑念珠菌（紫或白），其它念珠菌呈白色。3037培养48h后观察结果。,如为霉菌，应种于察氏琼脂，其对青霉、曲霉及镰刀霉都具鉴定作用。CSF应种于沙氏葡萄糖琼脂，分别置25C及37C培养1
10、周，血液种于脑心浸出肉汤，37C培养1周。,快速鉴定白色假丝酵母菌,玉米培养基：厚膜孢子血清芽管试验：出芽现象,曲霉,烟曲霉、黄曲霉最常见的病原菌曲霉球黑曲霉、烟曲霉多见肺曲霉病烟曲霉、土曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、亮白曲霉播散性曲霉病烟曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、局限曲霉耳真菌病黑曲霉脑曲霉病土曲霉鼻窦感染烟曲霉、黄曲霉,曲霉分类,Raper(1995年)18个群：132个种及18个变种新的变种在被不断发现至少有20个种能感染人和动物，常见约8个种,常见的致病曲霉种,烟曲霉（A.fumigatus）黄曲霉（A.flavus）构巢曲霉（A.nidulans）黑曲霉（A.niger）土曲霉（A.terr
11、eus）棒曲霉（A.clavatus）杂色曲霉（A.vewsicolor）,曲霉属的特征性结构,分生孢子头：由分生孢子梗茎、顶囊、瓶梗、梗基、分生孢子链顶囊：分生孢子梗顶部的可孕性膨大。顶囊表面有瓶梗（产孢细胞），可有单层、双层（瓶梗和梗基）或二者兼有足细胞：特化的厚壁膨大的菌丝细胞壳细胞：特化的厚壁的囊状细胞，形态各异,曲霉的真菌学检查,鉴定依赖于形态学特征直接镜检：痰、脓、痂皮、耵聍、甲屑、粪、尿方法：取标本少量于仔玻片上，加一滴10KOH，覆上盖玻片结果：可见分隔菌丝、分生孢子。有时可见分生孢子头、顶囊、小梗、闭囊壳及子囊孢子（有性期）,菌丝形态鉴别,念珠菌：菌丝较细，有孢子及假菌丝毛霉
12、菌：菌丝粗，约为曲霉菌丝的23倍，多不分隔,血清学检测抗原,1-3-D-葡聚糖测定原理,1-3-D-葡聚糖是真菌细胞壁的共有成分，通过检测1-3-D-葡聚糖的含量可用于评估患者是否真菌感染或感染的程度,1-3-D-葡聚糖测定的临床价值,提示有无真菌感染不能提示哪一种真菌感染含量与疗效与相关性特异性和敏感性不受抗生素影响,1-3-D-葡聚糖测定的正常值,10pg/ml 以下 无真菌感染10-20pg/ml 病情观察期大于20pg/ml 真菌感染,（一）念珠菌抗原甘露聚糖193 patients (392 samples); 43 with ICSensitivity SpecificityMan
13、nan (ag)40 %98 %Antimannan (ab)53 %94 %ag and/or ab80 %93 %,Sendid B et al, J Clin Microbiol 1999;37:1510-7,（二）抗原：半乳甘露聚糖Serial Aspergillus Galactomannan Screening,n = 362 high-risk neutropenic patientsSandwich ELISA 2 times weekly, 11.7% positiven = 30 proven IAn = 9 probable IAn = 264 with no IASen
14、sitivity89.7%Specificity98.1%PPV87.5%NPV98.4%,Maertens J et al, Blood 2001;97:1604-10,抗原检测,由于曲霉感染机体至机体应答产生抗体二周后才有显著升高。抗体检测对侵袭性曲霉感染的早期诊断帮助不大。抗原检测在曲霉感染的免疫学诊断中倍受青睐。抗原检测的标本可取血清、尿液、脑脊液及BAL 液等。被检测的抗原成分主要是半乳甘露聚糖(galactomannan , GM) 脂多糖。血清GM在感染后24 h即可检测出,并与病情严重程度一致。抗原检测方法较常用的是EL ISA、RIA 和乳胶凝集试验等。抗原检测的敏感性和特异
15、性因方法而异。,曲霉感染抗原检测的优点,结果稳定：检测不受患者免疫功能状况的影响;敏感性强：在临床症状出现同时或之前,便可在体液中检测出特异性抗原,故适宜于早期诊断;可判断预后及疗效：抗原浓度可随病情活动而变化,故有助于疗效的判定。,曲霉半乳甘露聚糖抗原测定,曲霉抗原乳胶凝集试验: 特异性:90-100%;敏感性:26-76%(15ng/ml)曲霉抗原EIA试验: 特异性:90%;敏感性:80-100%(1ng/ml)动态检测,每周二次,完成全基因序列测定的病原真菌,白念珠菌等致病性念珠菌新生隐球菌粗球孢子菌烟曲霉、构巢曲霉组织胞浆菌卡氏肺孢子虫,NCCL推荐的药敏方法,1997年推荐M27-
16、A方案，采用液体培养基稀释法，包括洪量法和微量法，用于酵母菌的药敏试验2002年颁布M38-A方案，洪量和微量法测试丝状真菌药敏试验,已被NCCLS认可的真菌药敏方法,美兰纸片扩散法，由辉瑞制药研制Etest方法，由瑞典AB BIODISK研制生产ATB方法，由法国生物梅里埃生产,美国临床实验室标准化委员会酵母菌纸片扩散法敏感试验2003年版方案介绍(NCCLS)M44-P,美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)M44-P 酵母菌纸片扩散法敏感试验方案，制定了氟康唑(fluconazole)和沃尔康唑(voriconazole)质控株的参考范围及 氟康唑的抑菌环解释标准。研究证实氟康唑对酵母
17、菌药敏 试验有较好的重复性，可准确地检测酵母菌对氟康唑的敏感性。,将0 .5麦氏浓度的酵母菌悬液涂布于含葡萄糖和美蓝的Mueller-Hinton (MH)琼脂上, MH琼脂补充葡萄糖和美蓝，可促进酵母菌生长并且改善了抑菌环边缘清晰度。贴上氟康唑及沃尔康唑纸片 35孵育18-24 h观察结果。,测量抑菌环直径近似到mm,在大约80抑制区判读为测量边界。这种主观判读和经验结合可获得良好的一致性，在抑菌环边缘或内部的极微小菌落(20)可忽略不计。试验前检查质控结果并且至少每周做1次质控。,氟康唑和沃尔康唑对标准菌株24 h抑菌环直径(mm)的质控允许范围标准菌株 氟康唑25g 沃尔康唑1g白念珠菌
18、ATCC90028 2839 3 1一42，近平滑念珠菌ATCC22019 2223 2837热带念珠菌ATCC750 26-37克柔念珠菌ATCC6258 1625,氟康唑纸片扩散法解释标准和相应的最小抑菌浓度解释标准 抑菌环直径(mm) MIC(gm1) S 19 8 SDD 1518 1632 R 14 64 注：敏感：s；剂量依赖敏感：SDD；耐药：R,Etest抗真菌药敏试条：二性霉素B(AP)5氟胞嘧啶(FC)酮康唑(KE)伊曲康唑(IT)氟康唑(FL) 起始浓度32 mg/L，终末浓度0.002 mg/L,ATB FUNGUS 2 法,由BioMerieux公司开发与微量稀释法条
19、件相近，培养基为半固体受试药物有ITC，FLC，二性霉素B和5-FC，定量包被在试剂条上受试菌为念珠菌和新生隐球菌，定量接种特点：简便，快速，直观；正在探讨与NCCLS法之间的一致性，可望进一步扩大受试菌种和受试药物,ROSCO Neo-Sensitab 酵母菌纸片扩散法药敏试验,改良Shadomy琼脂或RPMI 1640琼脂加热溶解后倒入9cm平皿（20ml）。新鲜具活力的纯化的酵母菌落以生理盐水制成5X105CFU/ml(配制成0.5麦氏浊度后再以生理盐水对倍稀释)接种：平皿先置35 干燥2025分钟，倾注0.5ml菌悬液于平皿表面，均匀涂布，用移液管吸除多余的菌液。35 干燥15分钟后贴
20、上药物纸片。培养：35 1824小时，如未见明显生长，再放24小时。隐球菌：30 4248小时。,Rosco Neo-sensitab抗真菌药敏纸片 用于常规抗真菌药敏试验敏感30mm 20mm 15mm 10mm中介23-29mm 12-19mm 10-14mm耐药22mm llmm 无抑菌圈 无抑菌圈药物氟胞嘧啶lOg CICLOPlROX 两性霉索B 灰黄霉素 克霉唑 伊曲康唑 益康唑 游霉素 氟康唑 制霉菌素 氟胞嘧啶lg ISOCONAZOLE 酮康唑 咪康唑 噻康唑 特比奈芬,正确评价真菌药敏试验的价值,临床疗效与体外药敏差异的来源,无局部感染体外药敏判断标准，用系统用药标准代替,
21、造成最大的差异。NCCLS推荐方法与认可方法间的差异终点判读产生大误差未找到真正致病菌,真菌体外药敏实验判断标准存在差异,目前NCCLS制定的药敏判断标准是以不同药物进入体内后血液中最高浓度与该药物体外最低抑菌浓度（MIC）间的关系所制定，如（一般情况）MIC最高血浓度为 R,存在的问题,抗真菌药物在个各局部组织分布浓度与血液不同，甚至高几倍或几十倍，局部用抗生素的药敏试验标准是什么?局部用抗生素是否不必进行试验,而凭经验用药?局部用药依据体外抗生素试验结果与临床疗效的相关性?,举例:伊曲康唑,在肺、肾、肝、骨、胃、脾和肌肉的含量是血药浓度的2-3倍伊曲康唑在皮肤和指甲中的浓度是血药浓度的5-
22、10倍,结论：200 mg 伊曲康唑一次剂量后各种内脏组织与血浆浓度的峰值比,Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 2001;26:159-169,真菌药敏结果观察与细菌有不同,Etest和纸片药敏抑菌环测量标准,对氟康唑、5氟胞嘧啶、伊曲康唑允许抑菌环内有20%待测菌生长，不同人判读的误差,ATB终点判读,药敏结果是准对真正致病菌,不易找到真正的致病真菌,正常人呼吸道和肠道均可存在少量的真菌标本中培养阳性不能提示感染目前无敏感指示系统感染真菌的指标,如何分析真菌实验报告？,念珠菌是正常人体胃肠道和咽部的正常菌群，所以不能以这些部位涂片见
23、到孢子或培养出念珠菌即作为真菌感染依据，必须与临床表现相结合来确定诊断。,如何分析实验报告？,念珠菌血症是造成高死亡率的重要因素，但某些病人血培养真菌阴性时也能发生系统性念珠菌感染。这一现象提示如发生念珠菌血症不仅应作为需开始系统抗真菌治疗的指征，同时应注意是否有胃肠道念珠菌扩散，有无其他系统的真菌感染。,如何分析实验报告？,其他无菌体液，如腹水、胸水、胆汁、脑脊液、新鲜尿液中检出念珠菌，其临床价值远高于胃肠道和咽部标本，阳性结果也应视其为临床开始抗真菌治疗的充分根据。,如何分析实验报告？,对血液培养真菌阴性，如何来判定其有否扩散性真菌感染？扩散性真菌感染中，内眼炎是仅次于真菌培养阳性的指标，
24、对高危病区和人群作眼科检查并采集相应标本作念珠菌涂片和培养（采二根拭子）是有重要意义。,有意义的涂片结果,机体内部标本如血液、腹水、C5F、脓肿穿刺液等新鲜尿液见到大量菌丝及孢子口腔、阴道、支气管灌洗液见到酵母样菌应作培养确定组织真菌涂片,MIC真菌药敏更有参考价值,局部真菌感染在参考真菌药敏结果的同时还应根据不同药物在不同组织中的药代特征，蓄积浓度，MIC与蓄积浓度的关系、抗真菌谱等考虑其有效性和病人对抵抗不良反应的能力来选择抗真菌药物。在药物浓缩部位感染时，既是 I或SDD的药物也有应用价值或在加大剂量后有应用价值真菌药敏报告应同时参考S、 I 、R和MIC，MIC结果可结合组织浓度判断药
25、物的有效性,在局部真菌感染时更应依据MIC和组织药物浓度判断敏感性,组织药物浓度的测定,是联系药敏试验和临床用药的桥梁以FLC为例： 剂量 组织浓度100mg/d 6g/ml 400mg/d 20-30g/ml 800mg/d 40-60g/ml Rex JH, Clin Microb Rev 1993, 6: 367-381,体外抗真菌药敏试验与体内疗效的一致性,NCCLS M27-A 600余株念珠菌MIC值：分离自150余例AIDS的食管念珠菌病，一致性好；治疗失败者，MIC值大于64 g/ml90-60原则MIC值与临床疗效 药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效 药敏试验耐药菌株：60%
26、对治疗有效 Mahmoud A.G, JCM 1996, 34:489-495；Rex J,CID 2002, 35: 982-989,体外抗真菌药敏试验指导用药,以FLC为例 MIC 剂量 5万cfu/ml,实验室二级危象,粪便涂片念珠菌20-30/油镜或占50%以上痰标本涂片或培养未见细菌，有大量菌丝及孢子。真菌数每油镜视野20口腔涂片未见细菌。真菌数2025/视野，有菌丝。培养：纯培养真菌阴道：培养出白色念珠菌。涂片见到菌丝和孢子,实验室三级危象,其他念珠菌、隐球菌、双相型真菌、曲霉菌、接合菌及新月孢子菌不属正常菌群，一旦阳性并排除污染后有诊断意义痰涂片细菌占1/3，真菌小分生孢子占2/
27、3，未见菌丝粪便涂片G菌仅占1/4，G菌占1/4，真菌占2/4，少量真菌菌丝口腔念珠菌培养阳性，涂片见到菌丝和孢子,氟康唑,MIC=64 R敏感:91% 对治疗反应好耐药：仍有48%有效氟康唑是浓度依赖性药物，疗效判断以AUC/MICAUC/MIC=日剂量/MIC,氟康唑MIC和剂量,念珠菌食管炎：AUC/MIC25菌血症:AUC/MIC50如何计算:报告临床MIC和真菌种即可推测剂量例:白色念珠菌血症,MIC=4mg/L,日剂量为4x50=200mg/L如MIC=16,日剂量为16x50=800mg/L,伊曲康唑,标准:S:MIC=1mg/l体内和提外相关差,感染组织浓度/MIC有利于推测疗
28、效,两性霉素B,按NCCLS M27-A的标准很难测出耐药,但临床确有治疗失败的病例目前通常以MIC=0.25mg/L代表耐药菌株以感染组织药物峰浓度/MIC代表体外活性.两性霉素B是浓度依赖性药物,所以加大剂量可提高疗效,5-氟胞嘧啶,为浓度依赖性药物,单独用药易耐药.NCCLS标准是基于联合用药制定MIC=16 R通常剂量25mg/L(6h 1)次,可达血药浓度40-60mg/L.该经验适用于隐球菌.,两性霉素B,MIC对丝状真菌一般是0.5-2mg/L但对土曲菌、枝顶孢霉、尖端赛多孢、足分支霉MIC可能超过2mg/L。MIC=2mg/L为耐药5-氟孢嘧啶和氟康唑对丝状真菌不敏感,MIC6
29、4mg/L,丝状真菌治疗依据,鉴定到种根据药物耐药谱指导用药有很好的预测性如土曲菌、枝顶孢霉、尖端赛多孢、足分支霉对两性霉素B耐药,新的抗霉菌药物,伏立康唑:可参照NCCLS M27-A标准检测酵母菌的MIC,与体内有良好的相关性卡泊芬净药敏结果与疗效相关性差,有报道用MIC=2mg的预后比MIC=1的还好卡泊芬净对丝真菌的药敏结果各实验室差异大无可比性,正确应用药物敏感试验结果,确定真正的致病菌本单位不间断的耐药监测数据是经验用药的重要参考PK/PD+MIC与疗效更接近在找到真正致病菌的前提下，药敏报告敏感提示有90%以上有效但报告耐药也可能60%有疗效。,内 容,真菌感染现状实验室对策1真
30、菌耐药监测提供经验用药依据2非培养方法争取最佳治疗时间3鉴定菌株到种4告诉医生如何应用真菌药敏结果SFI诊断和治疗策赂,念珠菌血症诊断标准及爆发流行的因素,SFI时应对宿主作评价诊断标准:确诊:Hostfactor、clinical features、tissue、microbiology可能感染：host factor、clinical festures、mycology可疑：host factor、clinical features或mycology,SFI系统性真菌感染临床诊断程序,危险人群B-D葡聚糖每周2-3次发烧5天CT结果支持可确诊,治疗的新概念,预防治疗目标预防:如用复方新诺明预防卡氏肺孢子菌先发治疗经验用药目标用药,下列真菌可能天然耐药,两性霉素B 氟康唑5-氟胞嘧啶白吉利毛孢子菌 杜伯林念珠菌 白念珠菌葡萄牙念珠菌 克柔念珠非白念珠菌土曲霉 光滑念珠菌 新型隐球菌帚霉菌 葡萄牙念珠菌曲霉菌属镰孢菌属 挪威念珠菌双相型真菌S. apiospermum 曲霉菌属,再见！,二一二年九月六日,
