1、PRRS的最新研究进展及展望,曾亮明,福州大北农生物技术有限公司Fuzhou Dabeinong Biotechnology Co.Ltd,主要内容,PRRS的研究进展我们的展望及对策,一、PRRS的研究进展,PRRSV基因及蛋白PRRSV免疫学特性PRRSV的遗传变异PRRS疫苗开发现状,1、PRRSV基因及蛋白,ORF1-a,5-,编码两个多聚蛋白,加工成15个非结构蛋白,Nsp1a、nsp1b、nsp2、nsp2TF、nsp3nsp12,N蛋白,M蛋白,GP5蛋白,ORF5a蛋白,GP4蛋白,GP3蛋白,E蛋白,GP2蛋白,何为病毒的非结构蛋白和结构蛋白？,病毒的非结构蛋白（nsp）主要
2、负责病毒的基因组转录、蛋白组装，是病毒复制的参与者，但不是成熟病毒粒子的组成成分。,病毒的结构蛋白参与病毒的感染，是成熟病毒粒子的主要组成成分。,编码生成15个非结构蛋白,PRRSV非结构蛋白( non-structural proteins, nsp)的功能,Nsp11：降解线粒体抗病毒信号蛋白MAVS的mRNA,抑制干扰素信号传导,nsp1a、nsp1b、nsp2、nsp4都是蛋白酶，nsp9是RNA聚合酶，nsp10是解旋酶，nsp11是核算内切酶。,Nsp1a、nsp1b、nsp2、nsp4、nsp11：下调巨噬细胞和树突状细胞型干扰素（IFN-a、 IFN-b）的产生。,Nsp2：结
3、合细胞靶位类泛素蛋白ISG15，改变宿主抗病毒反应。,INF-主要由单核巨噬细胞产生，INF-来源于成纤维细胞，而INF-主要产生于T细胞和NK细胞。,干扰素功能：1、抗病毒：是机体第一道病毒防御体系，先于机体的免疫应答反应；通过与靶细胞受体结合，诱导抗病毒蛋白（AVP）而间接发挥抗病毒作用，对病毒起抑制作；是目前所知的发挥作用最快的第一病毒防御体系，可在很短时间（几分钟内）使机体处于抗病毒状态，并且机体在1-3周内对病毒的重复感染有抵抗作用。2、免疫调节 ：促进抗原递呈，活化淋巴细胞。,ISG15可刺激产生IFN-；ISG15通过TNF-a介导细胞毒性反应；负责干扰素信号传导。,PRRSV可
4、以编码各种多功能蛋白，干扰机体天然免疫和获得性免疫的正常应答，具有逃避宿主免疫防御网络的选择性遗传优势。,编码8个结构蛋白,次要结构蛋白： GP2（ORF2）、 E(ORF2b)、GP3(ORF3)、 GP4(ORF4)、GP5a(ORF5a)主要结构蛋白：GP5(ORF5)、M(ORF6)、N(ORF7),能产生中和抗体的：GP2、GP3 、GP4、GP5、M。,产生抗体快又多的： M和N蛋白，N抗体（无中和特性）感染5d产生，M抗体10d产生，具有很好的诊断学意义。,易发生变异的蛋白：GP3、GP5,GP5诱导的最具保护性，但其中和表位受糖基化位点的修饰，导致中和抗体产生缓慢，含量低。,N
5、和M蛋白高度保守，可用来开发商业化PRRSV抗体ELISA检测试剂盒，IDEXX和金诺采用N蛋白，LSI采用M蛋白。,GP5是最主要的保护性抗原蛋白，包含中和抗体表位和特异性细胞免疫表位，GP5的高度变异是PRRSV逃避宿主特异性免疫的重要机制。,PRRSV结构蛋白（structural proteins）的功能,2、PRRSV的遗传变异,非结构蛋白的变异HP-PRRSV是怎样炼成的,nsp2编码区高度易变,不连续地缺失30个氨基酸,HP-PRRSV,区别经典PRRSV与HP-PRRSV的标记,Nsp2的变异使PRRSV发生了什么变化？,经典PRRSV特性主要攻击单核细胞（肺部、子宫内膜、胎盘
6、及淋巴组织等部位的巨噬细胞和树突状细胞）主要在下呼吸道及内部淋巴组织复制唾液酸黏附素（SN）是靶细胞内吞PRRSV的关键受体HP-PRRSV的特性可以在大量缺少唾液酸黏附素的单核细胞内复制复制能力更强，更易扩散（上呼吸道、脑部、血管内皮）在呼吸道的复制能力提高上百倍，如鼻粘膜，大大提高了其传播能力,SN主要表达于巨噬细胞及个别树突状细胞,HP-PRRSV的组织嗜性发生了改变,HP-PPRSV组织嗜性改变对疫苗选用的现实启示,HP-PRRSV疫苗比经典株在机体内定植范围更广，一旦产生非特异性细胞免疫，则对各组织器官的保护更全面。,毒力偏强的HP-PRRSV疫苗产生的组织损伤更广泛，主要表现为更多
7、组织内的巨噬细胞被破坏，导致更严重更广泛的免疫抑制。,HP-PRRSV能在呼吸道黏膜树突状细胞（唾液酸黏附素阴性细胞）内复制。呼吸道黏膜的树突状细胞分布网络像渔网一样捕获外来病原体，这些细胞一旦遭受破坏，像打开各种病原的入侵门户,弱毒株对细胞凋亡机制干扰作用小，能够诱导局部细胞凋亡机制的产生来抵抗急性感染,PRRSV结构蛋白的变异,GP3/GP5编码区高度易变,GP3、GP5、M，尤其GP5和M是诱导中和抗体和特异性细胞免疫应答重要结构蛋白,GP5的变异是PRRSV逃避特异性免疫保护的重要机制,影响疫苗的交叉保护力,M蛋白比较保守，和GP5一样诱导中和抗体，诱导的特异性细胞免疫应答比GP5更重
8、要，可能含有各毒株间主要交叉保护位点（特异性）。,PRRSV在国内的分子流行学,20102011华南地区PRRSV遗传进化分析（华南农大 张民泽等）20102011年，560个病样，62份阳性，分离到17株PRRSV基因分析发现17个毒株nsp2有30个氨基酸不连续缺失，GP5存在广泛的氨基酸替换，GP3抗原漂移17株都属北美基因型，2011年分离的4株与JXA1-R株具有很高的同源性,HP-PRRSV在南方地区广泛流行，JXA1-R株可能返祖，可能跟养猪环境和免疫不当有关。,南方地区5株PRRSV流行毒株的分子流行病学调查与研究（华南农大陈瑞爱等）从南方地区分离到5株PRRSV，ORF5测序
9、，与JXA1株相似性高达89.999.2%，与ATCC VR-2332株相似性仅87.289.4%ORF5基因推导的氨基酸序列也发生多出突变，但与JXA1株的同源性高达89.198%5个毒株的nsp2与HP-PRRSV有有相似的缺失位点,潜台词,华南地区HP-PRRSV流行广泛，流行毒株GP5与JXA1株同源性很高，要打江西株疫苗。,20062013鲁豫冀地区PRRSV分离鉴定与GP5蛋白的遗传变异分析（山东绿都 沈志强等）2006年至2013年分离18株PRRSV，GP5序列分析有16株与JXA1株的氨基酸同源性为95.597.5%，与CH1-a株同源性为89.691.5%另2株与经典美洲株
10、VR-2332株同源性97.598.5%,3、PRRSV免疫学特性,有关免疫学的几个概念PRRSV非特异性免疫反应PRRSV的特异性免疫反应,有关免疫的几个概念,非特异性免疫特异性体液免疫特异性细胞免疫,非特异性免疫,阻断作用；消化、呼吸等系统的黏膜可分泌化学物杀菌。,机体非特异性免疫的健全是特异性免疫有效建立的基础。,概念：亦称先天性免疫，是机体在长期种系发育和进化过程中逐渐形成的一系列防卫机制,天然免疫的组成皮肤与黏膜、血-脑屏障、血-胎屏障,免疫调节功能：抗原递呈（吞噬细胞）、信号传导（IFNa、IFNb）,吞噬、消化、杀灭功能：吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞、多形核中性粒细胞）、NK细胞
11、,机体对病毒入侵后的抵抗效应,天然免疫的组成细胞及功能,在抗原刺激下，B细胞被激活、增殖，产生抗体，此为特异性体液免疫应答。,特异性体液免疫应答,信息,信息,激活,强化激活,信息,激活,增强攻击,被吞噬,抗原递呈细胞（APC）包括巨噬细胞、B细胞等,B细胞直接接受抗原信息,TH细胞是特异性免疫的大管家，负责抗原信息收集，并对效应淋巴细胞（B细胞、Tc）发出指令,抗体（免疫球蛋白）的基本结构,可变区，与抗原结合区，与抗原表位构像互补，随特异性而变。,恒定区，由机体固有基因组编码，不因特异性而改变，不同种类的免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA、 IgD、 IgE、 ）存在差异。,铰链区与抗体分子构
12、型变化相关，当抗体与抗原结合时，该区能转动，以调节与抗原表位的结合，并导致抗体分子变构，从而暴露激FC片段。,FC片段，结合细胞（细胞表面的Fc受体）、激活补体等。,抗独特性抗体,可变区，与抗原结合区，与抗原表位构像互补，随特异性而变。,当将某头猪产生的抗体再注射到该头猪的体内；或多余的抗体滞留在体内，会发生什么现象？,抗原的内影像，也称抗独特型抗体，可以诱导产生与抗原一致的特异性抗体,B cell,中和性抗体,中和性抗体阻断病毒感染细胞；非中性抗体不能阻断病毒感染细胞,中和抗体与非中和抗体都能与病毒的相应抗原表位结合，通过FC片段激活补体系统，或与含FC受体的细胞结合，协助吞噬或清除病毒,体
13、液免疫作用是全身性的,含FC受体的细胞,抗原抗体复合物,特异性细胞免疫,由T细胞执行特异性细胞免疫应答。,物 以 类 聚人 以 群 分,多细胞生物自身基因同一性的维持,T细胞的任务是发现表达非己基因的细胞，并攻击排除之。另一方面，对只表达自己正常基因产物的细胞决不攻击。 那么T细胞究竟如何区别其中的不同点呢？T细胞表面有一种受体，与机体几乎所有细胞表面上所持有的、装载有多肽沟槽的MHC分子结合，查核其装载的多肽的形态结构，并取名为T细胞受体（T-cell receptor、TCR）经查核，如发现机体细胞表面MHC呈现的多肽非自身基因组编码产物，就开始攻击,T细胞的任务,细胞免疫过程需要很多细胞
14、因子（IFN-等）的介导，对感染细胞进行自我毁灭，让病毒无栖身之所，让感染损伤限制在很小范围。,PRRSV非特异性免疫,PRRSV干扰巨噬细胞和树突状细胞细胞因子（IFNa、IFNb等）的正常分泌,改变抗原递呈分子的表达，减缓先天性及特异性免疫应答,导致自然杀伤性细胞（NK cell）激活延迟,中和抗体反应、淋巴细胞增殖及IFN-产生迟缓,PRRSV特异性免疫反应,特异性体液免疫反应,N蛋白抗体可在感染后5 d检测到，无中和活性，感染后710 d开始出现中和抗体，但滴度极低，在中和抗体存在的情况下，PRRSV仍可在体内持续感染。,中和抗体与反应抗体均可增强PRRSV在巨噬细胞内的复制，同样，病
15、毒血症也可在中和抗体缺失的情况下消失，所以中和抗体能提供的免疫保护作用仍存异议。,M、GP2a、GP3、GP4和GP5蛋白的多肽均能够诱导中和抗体的产生；GP5诱导的中和抗体最具保护作用；所有PRRSV抗体中，抗N蛋白抗体最多，但无中和活性。,到目前为止，PRRSV感染诱导体液免疫反应对机体的保护效果及机制尚需进一步研究。,PRRSV特异性免疫反应,特异性细胞免疫反应,PRRSV感染猪体412周后，T细胞开始增殖，同时表达IFN-和IL-2，但是PRRSV在机体内持续感染，导致机体对抗PRRSV感染的细胞免疫相对较弱。,IL-10含量的增加可以增强PRRSV逃逸IL-2介导的细胞免疫反应，IL
16、-10的含量与IFN-反应呈负相关。,PRRSV可以激活针对其结构蛋白的、特异性的T细胞反应，其中M蛋白最具有诱导T淋巴细胞增殖的特性，针对GP5、M和N蛋白的特异性T淋巴细胞在PRRSV感染后4周可检测到，以M蛋白最强,PRRSV特异性免疫反应,抗体依赖性增强作用,在PAM培养物中加入一定效价的PRRSV抗体，可使PRRSV复制增强；同样，在病毒中加入PRRSV抗体后接种妊娠中期母猪，可使病毒在胎儿中的复制大为增强。,在生产中，经常见到感染PRRSV的刚断奶仔猪比生长肥育猪的临床症状严重得多，这说明ADE在PRRSV发病机理及免疫病理学中具有重要意义。,4、PRRSV疫苗开发现状,常规疫苗,
17、Boehringer Ingelheim1995年推出RespPRRSV/Repro（该疫苗在欧洲名称为Ingelvac PRRS MLV），主要用于318周龄猪的预防接种，一般不用于对母猪的免疫。,目前我国自主研发的有CH-1R株、R98株、JXA1-R株、HuN4-F112株和TJM-F92株等活疫苗。,TJM-F92株活疫苗,Nsp2蛋白有30个氨基酸不连续的缺失,120个氨基酸连续缺失,特点：毒力弱，可与经典株及其它HP-PRRSV区别。,HuN4-F112株活疫苗,常规疫苗特点,共性产生（非特异性、特异性）免疫保护迟缓免疫早期保护力差,差异针对各自进化谱系近的特异性保护力稍好，跟相关
18、结构蛋白（GP5）同源性相对更高有关毒力有差异,新型疫苗,DNA疫苗（山东省农业科学院畜牧兽医研究所 杜以军等）共表达IFN-a、IFN-和GP3、GP5蛋白对HP-PRRSV SD-JN株能够提供短期和长期攻毒保护,重组疫苗（中国农业科学院上海兽医研究所 童光志等）利用感染性分子克隆技术，以HuN4-F112株为载体，在其ORF1b和ORF2a间插入猪源GM-CSF和PRRSV ORF6转录调控序列，获得重组病毒RNA，并在Marc-145获得拯救病毒重组病毒保持了亲本毒的增殖特性，遗传稳定（传20代）,双标记疫苗（中国农业科学院上海兽医研究所 童光志等）利用感染性分子克隆技术，以HuN4-
19、F112株为载体，在其nsp2区敲除75个碱基，插入NDV NP主要抗原编码基因，获得重组病毒RNA，并在Marc-145获得拯救病毒制备了针对nsp2敲除区和插入片段的两种ELISA试剂盒传20代遗传稳定，通过两种ELISA试剂盒可区别疫苗毒和野毒,IFN-a 、IFN-改善疫苗非特异性和特异性免疫。,GM-CSF为猪源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，能募集、活化树突状细胞，并促使其成熟，从而改善疫苗的特异性免疫,非肌肉肌球蛋白重链A（F）是PRRSV靶细胞受体，PRRSV GP5蛋白与之存在结合位点。将抗体GP5蛋白抗体注射小鼠，制备单克隆抗体，该单克隆抗体能与Marc-145及PAM的“F
20、”结合，阻断PRRSV感染，该单克隆抗体即为GP5上能结合“F”的位点的内影像，以之免疫机体能产生针对该位点的特异性抗体，起到中和保护作用。,抗独特型抗体疫苗（西北农林科技大学 周恩民等）制备了一株模拟PRRSV GP5抗原的单克隆抗独特型抗体（Mab-5G2）非肌肉肌球蛋白重链A（F）是PRRSV靶细胞受体，PRRSV GP5蛋白与之存在结合位点。该抗体可以结合肌肉非肌球蛋白重链A，阻断PRRSV感染以HP-PRRSV攻毒证明免疫效果显著,GP5抗原,非肌肉肌球蛋白重链A,抗GP5抗体,制备针对可变区的单克隆抗体,GP5内影像，可作为疫苗免疫,二、展望及对策,现有PRRSV疫苗的不足未来PR
21、RSV发展的方向蓝定抗的优势及存在的不足对蓝定抗深度推广的几点建议,Viral LoadIn Tissues,Exposure to PRRSV,Viremia,Total Antibody Response(measured) By ELISA,Neutralizing AntibodyResponse,1、现有PRRSV疫苗的不足,没有解决PRRSV免疫逃避问题即使对同源毒株也无法提供早期保护经过长期免疫，建立特异性免疫后，可能对同源毒株能提供特异性保护致力于追求毒株的“与时俱进”皆非上策PRRSV田间毒株的基因多样性，导致单一疫苗毒株的交叉保护性无法涵盖田间所有的流行毒株PRRSV GP5的高变异性，导致疫苗毒株的研发速度跟不上现实的变化,2、未来PRRSV疫苗发展方向,克服PRRSV免疫逃避机制，改善疫苗的非特异性免疫和特异性免疫反应利用现代分子生物学技术，构建能正常刺激产生免疫因子的疫苗（活载体嵌合疫苗、DNA疫苗、重组疫苗）添加外源免疫因子，协助疫苗正常应答（佐剂）扩大疫苗的交叉保护力利用现代分子生物学技术，筛选PRRSV的保守抗原区，开发重组疫苗重组疫苗构建的同时也实现了标记疫苗的目的,谢谢！,
