1、实验十 薄层色谱和柱色谱1. 实验目的 了解薄层色谱和柱色谱的基本原理； 学习用薄层色谱和柱色谱分离、纯化有机化合物的技术2. 实验原理 色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。 其基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相(可以是固体或液体)。根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱等。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂
2、本身不起分离作用。根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。 薄层色谱：薄层色谱属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。适用于小量样品(几到几十微克，甚至 0.01g 的分离。此法特别适用于挥发性较小或者在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。其可分为吸附色谱和分配色谱。由于不同组分被固定相吸附程度不同，在流动相中溶解程度不同，因此，不同组分移动的距离不同，因而形成了互相分离的斑点=溶质的最高浓度中心至原点中心的距离 溶剂前沿至原点中心的距离薄层色谱用的吸附剂和支持剂：薄
3、层色谱常用的吸附剂或支持剂是硅胶或氧化铝。薄层色谱用的硅胶分为硅胶 H 不含粘合剂；硅胶 G 含煅石膏做粘合剂；硅胶 HF-254 含荧光物质，可在波长 254nm 紫外光下观察荧光；硅胶 GF-254 含有煅石膏和荧光剂。薄层色谱用的氧化铝也分为氧化铝 G、氧化铝 GF254 及氧化铝 HF254。 薄层板的制备：简易平铺法，如称取约 3g 硅胶 G，加入到 67mL 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液中，调成均匀的糊状物(可铺 78 张载玻片)。这一步一定要将吸附剂逐渐加入到溶剂中，边加边搅拌；如果把溶剂加到吸附剂中，容易产生结块。然后采用和倾斜法将糊状物涂布在干净的载玻片上，制成薄层板。 薄
4、层板的活化：涂好的薄层板室温水平放置晾干后，放入烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持 105110 活化 30min。氧化铝板在 200220 烘 4h 可得活性级的薄板。150160 烘 4h 可得活性 级的薄板。薄层板的活性与含水量有关，其活性随含水量的增加而下降。注意硅胶板活化时温度不能过高，否则硅醇基会相互脱水而失活。活化后的薄层应放在干燥器内保存。 点样：将样品溶于低沸点溶剂(丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳)配成 1%的溶液，用内径小于 1mm 管口平整的毛细管点样：用毛细管取样品溶液，在薄层板一端约 1.0cm 处，垂直地轻轻地接触到薄
5、层上的吸附剂，样品溶液就可靠到薄层上。在薄层色谱中，样品的用量对物质的分离效果有很大影响，所需样品的量与显色剂的灵敏度、吸附剂的种类、薄层的厚度均有关系。样品太少，斑点不清楚，难以观察；样品量太多，往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，样点直径一般以 24mm 为宜。同一薄层上的样点直径应一致。另外点样要轻，不可刺破薄层。 展开：倾斜上升法：先将一定量展开剂放在色谱缸中，盖上缸盖，再将点好试样的薄层板样点一端朝下放入缸内，盖好缸盖，展开剂因毛细管效应而沿薄层上升，样品中组分随展开剂在薄层中以不同的速度自下而上移动而导致分
6、离。当展开剂前沿上升到样点上方 810cm 时取出薄层板，放平，铅笔标明溶剂前沿位置，冷风吹干溶剂。显色：展开的薄层板上化合物斑点本身有颜色时，可直接观察。若化合物本身无色，可在紫外灯下观察荧光斑点，也可用显色剂显色。简单常用的显色剂是碘蒸气，广口瓶中放置少量碘晶体，使用时将薄层板放入，盖上瓶盖，密封瓶内的碘蒸气即可使大部分有机化合物显色(饱和烃与卤代烃除外)。 柱色谱：原理与薄层色谱类似，常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往
7、下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。 吸附剂：实验室常用氧化铝、硅胶作吸附剂。吸附剂的选择一般要根据待分离的化合物类型而定。例如硅胶的性能比较温和，属无定形多孔物质，略具酸性，适合于极性较大的物质分离；同时硅胶极性相对较小，适合于分离极性较大的化合物，如羧酸、醇、酯、酮、胺等。而氧化铝极性较强，对于弱极性物质具有较强的吸附作用，适合于分离极性较弱的化合物。酸性氧化铝适合于分离羧酸或氨基酸等酸性化合物；碱性氧化铝适
8、合于分离胺；中性氧化铝则可用于分离中性化合物。大多数吸附剂都能强烈地吸水，且水分易被其它化合物置换，因此吸附剂的活性降低。因此吸附剂使用前一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言，粒度愈小表面积愈大，吸附能力就愈高，但颗粒愈小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。 溶质结构与吸附能力的关系：化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强，各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减：酸和碱醇、胺、硫醇酯、醛、酮芳香族化合物卤代物、醚烯饱和烃溶剂：柱色谱分离中，洗脱剂的选择是重要的一环，通常根据被分离物中各化合物的极性、溶解度和吸附剂的
9、活性等来考虑。但是必须注意，选择的洗脱剂极性不能大于样品中各组分的极性。否则样品组分在柱色谱中移动过快，不能建立吸附-洗脱平衡，影响分离效果。实际操作时，一般采用薄层色谱反复对比、选择柱色谱的洗脱剂。能在薄层色谱上将样品中各组分完全分开，即可作柱色谱洗脱剂。在有多种洗脱剂可选择时，一般选择目标组分 Rf 值较大的洗脱剂。一般来说，洗脱剂都需要采用混合溶剂，利用强极性和弱极性溶剂复配而成。 ：硅胶和氧化铝作吸附剂的柱色谱，洗脱剂的洗脱能力有如下顺序： 己烷和石油醚环己烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸。3. 实验药品和仪器偶氮苯的苯溶液，苏丹 II
10、 的苯溶液，苏丹 III 的苯溶液，乙醇，石油醚，亚甲基蓝和荧光黄的混合溶液薄层板，色谱柱，漏斗，毛细管4. 实验步骤 点样：在薄层板距一端 1cm 处用铅笔轻轻划一横线，取毛细管插入样品溶液中，在一块板起点线上点偶氮苯、苏丹 II、混合液三个样本点，在第二块板起点线上点偶氮苯、苏丹 III、混合液，第三块板上点偶氮苯、未知样、混合液。 在缸内配置乙醇和石油醚 4:1 的混合溶液作为展开剂，待样点干燥后，将薄层板放入展开。观察展开剂前沿上升至离板的上端 1cm 处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，比较二者 Rf 值的大小。 在色谱柱内依次加入 0.5cm 厚的石英砂、到柱高 3/4
11、 处的氧化铝、0.5cm 厚的石英砂，填装紧密。将烧杯置于色谱柱下端，将乙醇加入色谱柱至没过表面。当液面下降至氧化铝上端表面时，加入亚甲基蓝和荧光黄的混合溶液。用乙醇淋洗保持湿润，直至观察到色层带的形成和分离，改用乙醇与水的混合溶液淋洗，分层明显后再换用水淋洗。当亚甲基蓝带到达柱底时，立即换另一接收器，收集全部此色层带，然后换另一接收器收集荧光黄色层带。5. 实验注意事项 色谱柱填装的紧密与否，对分离效果很有影响。若柱中气泡或各部分松紧不均时，会影响渗透速率和显色均匀。但如果过分敲击，又会因为太紧密二流速太慢。 为了保持色谱柱的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的。否则当柱中溶剂或溶
12、液流干时，就会使柱身干裂，影响渗滤和显色的均一性。6. 实验数据记录与处理7. 实验思考与讨论 在一定操作条件下为什么可利用 Rf 值来鉴定化合物？答：在特定的展开剂中，Rf 值几乎可以认为是物质的特性之一。取标准品和样品，如果在两个以上的展开剂系统中，样品都有和标准品相同 Rf 的点，基本可以确定样品中含有标准品。如果样品在多种展开剂中，都显示只有一个点，而这个点的 Rf 和标准品（或者报道的标准品的）Rf 总是相同，那么此样品就是标准品所含物质。TLC 用于鉴定，是最简便而又常用的方法之一。 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？答：薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样
13、品的极性，溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑。凡溶剂的极性越大，则对化合物的洗脱力也越大，也就是说 Rf 值也越大， （如果样品在溶剂中有一定溶解度） 。因为根据溶剂的极性，化合物的极性及Rf 值，可知各组分在薄层板上的位置。 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？答：这样所点试样将被溶剂所洗脱，薄层色谱无法展开。 柱色谱中为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？答：根据相似相溶原理，极性大的组分在极性大的溶剂中溶解度较大，易于洗脱。 柱中若留有空气或填装不均，对分离效果有何影响？如何避免？答：造成洗脱剂流动不规则而形成沟流，引起色谱带变形，影响分离效果。向柱子中倒入溶剂约为柱高 3/4 处，打开活塞，然后慢慢加入吸附剂，用木棒或带橡皮管的玻棒轻轻敲打柱身下部，使填装紧密。
