1、第三节 血小板检查,孔 山,一、血小板计数 PLT是测定全血中的血小板数量浓度，是止凝血检查最基本、最常用的试验之一,【方法学评价】血细胞计数中，血小板计数最为困难，这是因为：血小板体积小，其形态的识别，特别容易受其他杂物的干扰。血小板在体外易于粘附、聚集和变性破坏。目视显微镜计数法，由于人工操作、干扰因素较多，重复性差，故要求检验者要有丰富的识别各种血细胞形态的能力。,1、普通光镜直接计数法 破坏红细胞的溶血法：草酸铵稀释液法，对红细胞破坏力强，血小板形态清楚。尿素稀释法因尿素易于分解，有时不能完全溶解红细胞，故识别血小板困难；需保持新鲜。赤血盐(高铁氰化钾)稀释法，试剂稳定，可在室温下长期
2、保存而不变质，但红细胞破坏也不完全，影响准确计数。不破坏红细胞法：如复方碘稀释液(Agasse Lafont)，因红细胞未破坏，可掩盖血小板，且此液易生长微生物而干扰计数，已被淘汰。,2、相差显傲镜直接计数法 用相差显微镜计数经草酸铵稀释液稀释后的血液血小板，易于识别，还可照相后核对计数结果，因而国内外现仍将本法作为血小板计数的参考方法。3血液分析仪法重复性好，是目前临床筛检疾病的主要检验仪器。仪器法中，激光法比电阻抗法准确性高，但仪器细胞计数不能将血小板与其他类似大小的物质(如红细胞碎片、白细胞碎片或灰尘等杂物)完全区别开来。因此，当血小板数远低于参考值范围而怀疑计数结果准确性时，仍需借助目
3、视显微镜计数法进行复查校正。,【参考值】 (100300) 109L血小板增多(血小板数超过400 109 L)血小板减少（血小板少于100 109 L ）,【临床意义】 1、生理性 正常人血小板数随时间和生理状态变化： 如一天之内可增减6一10；午后略高于早晨；春季较冬季低；平原居民较高原居民低，月经前减低，月经后增高；妊娠中晚期增高，分娩后即减低，运动、饱餐后增高，休息后恢复。静脉血血小板计数比毛细血管血高10。,2病理性 (1)临床上，血小板减低是引起出血常见原因。当血小板在20109 L 50109 L时，可有轻度出血或手术后出血症状；当低于20109 L ，可有较严重的出血；低于51
4、09 L时，常严重出血。,常见疾病有：血小板生成障碍：如急性白血病(acute leukemia，AL)、再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)。血小板破坏过多：如ITP、脾功能亢进(hypersplenism)、系统性红斑狼疮。血小板消耗增多：如DIC、TTP。分布异常先天性,(2)血小板增多骨髓增生性疾病(约占住院患者的13)：慢性粒细胞白血病，真性红细胞增多症。原发性血小板增多症。急性大出血，急性溶血，急性化脓性感染(约占住院患者的3l)。近期外科手术、尤其是脾切手术后患者(占19)。其他疾病：心脏疾病、肝硬化、慢性胰腺炎、烧伤、肾功能衰竭、先兆子痫、低温。值得注意的是：
5、在不明原因的血小板增高标本中，约有50来自恶性疾病患者。,第四节 血栓和止血常用筛检试验,生理性止血机制(包括血管壁、血小板和凝血系统)与抗凝血、纤维蛋白溶解系系统)处于相互制约、动态平衡状态，始终维持着血管内血流畅通。当局部血管损伤则迅速启动止血机制，在损伤处形成血凝块，出血停止；同时，抗凝血系统和纤溶系激活，限制了血凝块的延伸。止血生效后，机体止血功能中止，而转向生理性的纤溶解，局部暂时阻塞的血管再通，血流又恢复正常。这样，机体局部受损时，既不会出血不止也不会因止血而引发广泛性血栓形成或栓塞。,在病理情况下，止血、抗凝血或纤溶任一个或数个系统发生异常，则可因失去平衡导致出血或血栓形成。止血
6、缺陷或纤溶亢进可引起出血难止，而抗凝和纤溶缺陷可致高凝状态或血栓形成。,止血、凝血和纤溶机制,一、正常止血机制二、正常凝血机制三、正常纤溶机制,一、正常止血机制 正常止血依赖于 完整的血管壁结构和功能 有效的血小板质量和数量 血浆凝血因子活性,常用筛检试验,常用筛检试验有：毛细血管脆性试验、出血时间、血小板计数、血块收缩时间、凝血时间测定、血浆凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、纤维蛋白(原)降解产物和D二聚体测定。,一、凝血酶原时间测定 PT是在体外模拟外源性凝血的全部条件，测定血浆凝固所需的时间，用以反映外源凝血因子是否异常，是筛检止凝血功能最基本、最常用的试验之一。,【检测原
7、理】 手工法和血液凝固仪法PT测定(包括半自动和全自动仪)目前均采用Quick于1935年创建的一步凝固法：在抗凝血浆中，加入足够量的组织凝血活酶(含TF)和适量的钙离子，即可满足外源凝血的全部条件。从加钙离子到血浆凝固开始所需的时间即血浆凝血酶原时间。,强调1手工法 手工法虽重复性差、耗时，但仍有相当程度的准确性，且操作简便，故仍在临床应用，并可作为仪器法校正的参考方法。,2 全自动仪法(加样、加试剂全部自动化)使检测更加精确、快速、敏感和简便；同时，仪器测定法所用的试剂、质控物、标准品均有可靠的配套来源，保证了试验的高精度。但在临床诊断的准确性方面，仪器法并不比手工法更高。,【质量控制】
8、血液标本采集、抗凝剂用量、仪器和试剂、实验温度以及PT检测报告的方式均对PT试验的准确性产生重要的影响。由于缺乏统一标准、统一试剂和技术，每一PT测定的参考值均随所用的检测方法、仪器和试剂而变化，因此，严格按仪器和试剂的操作要求进行认真的检测比选择测定的方法更为重要。,1、标本采集和处理（1）患者的准备：患者应停用影响止凝血试验的药物至少1周。(2)抗凝剂：国际血液学标准化委员会推荐用于止凝血试验的抗凝剂为0.109M枸橼酸钠其与血液的容积比为1：9，这个比例是基于标本血Ht在正常范围内，但若标本血的Ht异常增高或异常减低时，由于枸橼酸离子不能进入红细胞内，如不调整适合不同Ht的抗凝量，则可使
9、PT延长或缩短。矫正公式： 抗凝剂用量0.00185X血量(ml)X(100一患者Ht)。,(3)采血和处理：止血带：使用时间要短容器：使用高质量真空带盖采血管或硅化管或塑料管采血：必须顺利(否则可激活凝血因子)，“一针见血”，避免溶血(采血时混入组织因子或产生气泡，离心：凝血检测用的血标本应单独采集、立即分离血浆，按规定的离心力除去血小板。标本：创伤性或留置导管的血标本以及溶血、凝血不适宜做凝血试验。,(4)储存温度和测定时间：温度低，虽可减缓凝血因子的失活的速度，但低温可活化F、F。如储存血标本，也要注意有效时间，储存时间过长，凝血因子(尤其F)的活性明显减低，因此，从标本采集到完成测定的
10、时间通常不宜超过2h。(5)测定：手工法测定，标本温浴时间不宜低于3min，也不宜超过10min；判断何时为纤维蛋白形成(血液凝固)则是测定PT的关键性技能之一。仪器法测定必须按规范的操作要求进行，不能随意改变测定的条件；不同仪器、不同凝固法的终点判断原理不一，应建立各自的参考值。,2组织凝血活酶试剂质量 PT检测凝血因子，其灵敏度的高低依赖于组织凝血活酶(thromboplastin)试剂的质量。试剂可来自组织抽提物，现也用纯化的重组TF(recombinanttissuefactor，rTF)加磷脂作试剂。rTF比动物性来源的凝血活酶对F、F、FX灵敏度更高。,组织凝血活酶的不同来源、不同
11、制备方法使各实验室之间及每批试剂之间PT测定结果差异较大，可比性差，特别影响对口服抗凝剂患者治疗效果的判断，因此，必须使用已经表明国际敏感指数(international sensitivity index，1Si)的试剂。 为了校正不同组织凝血活酶之间的差异，早在1967年，世界卫生组织就将人脑凝血活酶标准品(批号6740)作为以后制备不同来源组织凝血活酶的参考物，并要求计算和提供每批组织凝血活酶的ISI。,ISI表示标准品组织凝血活酶与每批组织凝血活酶PT校正曲线的斜率。即在双对数的坐标纸上，纵坐标是用标准品测定的PT对数值，横坐标是用待校正的组织凝血活酶测定相同标本PT的对数值。批号67
12、40的组织凝血活酶的参考物ISI为1.0。ISI值越小，表示试剂愈敏感。,对口服抗凝剂的患者必须使用国际标准化比值(internationalnormalizationratio，INR)作为PT结果报告形式，并用以作为抗凝治疗监护的指标。 INR(患者凝血酶原时间正常人平均凝血酶原时间)IsI。,作PT测定时，首先应了解所用的组织凝血活酶试剂的ISI，ISI值通常由生产试剂的厂商提供，测定PT后，即可计算出INR。INR也可从试剂制造商提供的图表中查得。最初规定INR必须使用手工法测得；在引入凝血仪后，制造商还应提供相应仪器的ISI值。使用ISI和INR可缩小各实验室PT测定在技术上和试剂上
13、差异，使抗凝疗法监测中，各种PT的检测结果有可比性。,4PT测定的正常对照 WHO等国际权威机构要求，每次(每批)PT测定，PT正常对照值必须至少来自20名以上男女各半的混合血浆所测得的结果。目前，许多试剂制造商能提供100名男女各半的混合血浆作为对照用的标准血浆。5PT的报告方式 一般情况下，可同时报告被检标本PT(s)和正常对照PT(s)以及PT比率。凝血酶原比率(prothrombinrate，PTR)被检血浆PT正常血浆PT。过去曾用凝血酶原活动度报告，现已少用。当PT用于监测口服抗凝剂用量时，则必须同时报告PT的INR值。,整个PT试验均应置于质量保证(quality assuran
14、ce，QA）系统之下：包括正确的标本采集和处理、优选的检测方法、可靠的结果记录。并执行：内部质量控制(internal quality control)：常用质控物或患者标本进行监控，以反映检测的精确性。外部质量控制可通过参加室间质量评价(external quality assessment，EQA)进行，以确保不同实验室之间或方法学之间的可比性。,【参考值】 每个实验室应建立所用测定方法相应的参考值。通常成人：1115s；新生儿延长23s；早产儿延长35s(34d后达到成人水平)。PTR：085115。INR：口服抗凝剂治疗不同的疾病，需不同的INR。,【临床意义】 PT是检测外源性凝血因
15、子有无缺陷的敏感的筛检试验，也是监测口服抗凝剂用量有效的检测指标。 1、 PT延长 PT超过正常对照3秒以上或PTR超过参考值范围即为延长。先天性F、FV、F、FX减低及纤维蛋白原缺乏，或无纤维蛋白原血症、异常纤维蛋白原血症。获得性凝血因子缺乏，当F、FV、F、FX浓度低于正常人水平40时，PT即延长。,2PT缩短 先天性FV增多。DIC早期(高凝状态)。口服避孕药、其他血栓前状态及血栓性疾病,3口服抗凝药的监测 临床上，常将INR为24时作为口服抗凝剂治疗时抗凝浓度的适用范围。当INR大于45时，如纤维蛋白水平原和血小板数仍正常，则提示抗凝过度，应减低或停止用药。当INR低于45，而同时伴有
16、纤维蛋白原和(或)血小板减低时，则可能是DIC或肝病等所致，也应减低或停止口服抗凝剂。口服抗凝剂达有效剂量时的INR值：预防深静脉血栓形成1525，治疗静脉血栓形成、肺栓塞、心脏瓣膜病为2030，治疗动脉血栓栓塞、心脏机械瓣膜置换、复发性系统性栓塞症为30450。,二、活化部分凝血活酶时间测定 APTT是在体外模拟内源性凝血的全部条件，测定血浆凝固所需的时间，用以反映内源凝血因子是否异常，是筛检止凝血功能最基本、最常用的试验之一。【检测原理】 手工法和血液凝固仪法(包括半自动和全自动仪)活化部分凝血活酶时间测定：在抗凝血浆中，加入足量的活化接触因子激活剂(如白陶土)和部分凝血活酶(代替血小板磷
17、脂)， 再加入适量的钙离子即可满足内源凝血的全部条件。从加入钙离子到血浆开始凝固所需的时间即为活化部分凝血活酶时间。,【方法学评价】 手工法和仪器法测定APTT的方法分别类似PT的测定，1、手工法虽重复性差、耗时，但操作简便、有相当程度的准确性，现仍作为参考方法。2、仪器法APTT检测快速、敏感和简便，所用配套的试剂、质控物、标准品均保证了试验的高精度；但在诊断的准确性方面，仪器法并不比手工法更高；且仪器本身也会产生一定误差。 APTT是一个较为敏感的检测内源凝血因子缺乏的简便试验，已替代普通试管法CT测定。,【质量控制】 类似PT测定：血液标本采集、抗凝剂用量、仪器和试剂、实验温度等均对AP
18、TT试验的准确性产生重要的影响，故对实验的要求基本与PT测定相同。 由于缺乏标准的试剂和技术，APTT测定的参考值也随所用的检测方法、仪器和试剂而变化。 因此，按仪器和试剂要求进行认真检测比选择测定的方法更为重要。,1、激活剂和部分凝血活酶试剂： APTT测定因所用的激活剂不同以及部分凝血活酶来源及制备的不同，均可影响测定结果 激活剂：常用的有白陶土(此时APTT又称为kaolin partial thromboplastin time，KPTT)还可用硅藻土、鞣花酸(elagicacid)。即使是同一种激活剂，其质量也可有很大的不同；最初。APTT是用采血容器玻璃试管直接激活接触因子，后来加
19、入高质量的激活剂，使激活作用更迅速、更标准化，从而在一定程度上消除了接触激活造成的差异。,部分凝血活酶(磷脂)：主要来源于兔脑组织(脑磷脂)；不同制剂质量不同，一般选用F、F和F的血浆浓度为200250UL时敏感的试剂。2、标本采集和处理：基本要求同PT试验。注意：冷冻血浆可减低APTT对狼疮抗凝物以及对、HMWK、PK缺乏的灵敏度；室温下，F易失去活性，因此，恰当的标本处理非常重要；高脂血症可使APTT延长。,【参考值】 每个实验室应建立所用测定方法相应的参考值。2507350s(通常35s)。,【临床意义】 APTT的长短反映了血浆中内源凝血系统凝血因子(、)、共同途径中F、FI、FV和F
20、X的水平。目前所用的大多数APTT测定方法，可检出低于正常水平15一30血浆凝血因子的异常。APTT对F和F的缺乏的灵敏度比对F、F和共同途径中的凝血因子的缺乏的灵敏度高。,必须注意的是，单一因子(如因子F)活性增高就可使APTT缩短，其结果则可能掩盖其他凝血因子缺乏的情况。1、APTT延长 APTT结果超过正常对照10s以上即为延长。主要用于发现轻型的血友病。可检出F活性低于15血友病甲，中、轻度F、F、F缺乏时，APTT可正常。,2APTT缩短 见于DIC早期、血栓前状态及血栓性疾病。3监测肝素治疗 APTT对血浆肝素的浓度很为敏感，是目前广泛应用的实验室监测指标。此时，要注意APTT测定
21、结果必须与肝素治疗范围的血浆浓度呈线性关系，否则不宜使用。一般在肝素治疗期间，APTT维持在正常对照的1530倍为宜。4APTT的混合试验,三、凝血酶时间测定 TT测定主要反应凝血共同途径纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程中，是否存在异常的抗凝现象(抗凝或纤溶亢进)。【原理】 在受检血浆中用加入“标准化”凝血酶溶液，直接将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，测定血浆开始凝固所需的时间。,【方法学评价】 TT测定方法类似PT、APTT测定，有手工法和血液凝固仪法，均采用疑固法原理。【质量控制】 血液标本采集、储存温度和时间、抗凝剂用量、仪器和试剂、实验温度等均对TT试验的准确性产生重要的影响，对实验条件的要求
22、基本与PT测定相同。,【参考值】 每个实验室应建立所用测定方法相应的参考值。一般1618s。【临床意义】 受检TT值延长超过正常对照3s为延长。TT测定主要用于检测有无纤维蛋白原异常、以及是否发生纤溶、存在抗凝物的情况。延长见于：低(无)纤维蛋白原血症(Fg低于7001 000mgL)、遗传性或获得性异常纤维蛋白原血症；血FDP增高(DIC)，存在肝素和类肝素物质,四、纤维蛋白原含量测定 直接测定血浆Fg含量，可反映Fg增高或减低的实际状态。【检测原理】,【方法学评价】1、 Clauss法 此法为功能检测，操作简单、结果可靠，故被WHO推荐为测定Fg的参考方法。 当凝血仪通过检测PT方法来换算
23、Fg浓度时，如结果可疑，则应用Clauss法复核确定。2免疫法、比浊法、化学法操作较繁，均非Fg功能检测法，故与生理性Fg活性不一定总是成平行关系。,【质量控制】 Clauss法参比血浆必须与检测标本同时操作测定，以便核对结果；如标本中存在肝素、FDP或罕见的异常Fg，则Clauss法测定的Fg含量可假性减低，因此，需用其他方法核实。【参考值】成人24gL。新生儿：1253gL。,【临床意义】 Fg含量测定主要用于出血性疾病(包括肝脏疾病)或血栓形成性疾病的诊断以及溶栓治疗的监测。1增高 Fg是急性时相反应蛋白，也是红细胞沉降率增快最主要的血浆蛋白，在组织坏死和炎症时、妊娠和使用雌激素时。Fg
24、水平超过参考值上限是冠状动脉粥样硬化心脏病和脑血管病发病独立的危险因素之一。Fg增高还见于糖尿病、恶性肿瘤等,2、减低 见于：肝脏功能受损的疾病如肝硬化、DIC、药物、遗传性异常Fg血症或无Fg血症(极少见)。3、溶栓治疗监测 Fg测定可用于溶栓治疗(如用UK、tPA)、蛇毒治疗(如用抗栓酶、去纤酶)的监测。,五、D二聚体测定 D二聚体是纤溶酶降解交联的纤维蛋白的产物，对继发性纤溶的诊断具有特异性。【检测原理】1胶乳凝集法 抗DD单克隆抗体包被于胶乳颗粒上，与受检血浆中存在的DD产生可见的凝集反应。2酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA
25、)法,【方法学评价】1胶乳法 检测结果简便、快速，可由肉眼判断。使用血浆比使用血清更方便和更准确。检测时间短(反应时间3min)。2ELISA法 灵敏度高，但检测时间长。【质量控制】 均需作阴性和阳性对照试验。【参考值】 阴性或025mgL,临床意义 DD测定主要用以诊断继发性纤溶亢进症。 1阳性：继发性纤溶亢进症：DIC组织纤溶酶原激活物的溶纤疗法。动脉或静脉血栓性疾病其他疾病：如妊娠(尤其产后)、恶性肿瘤、手术等,2原发性或继发性纤溶亢进症鉴别诊断 由于纤维蛋白原及其降解产物均不与DD抗体反应，因此，DD阳性可认为是继发性纤溶如DIC或其他血管内血栓形成的证据。 DD检测是鉴别原发性和继发
26、性纤溶的良好指标：在血栓形成中的灵敏度达9095，虽特异性仅为3040，但阴性预测值可达95以上，即DD检测如阴性，则基本可排除血栓形成。,弥散性血管内凝血1DIC的概念 DIC是由多种致病因素(严重感染、组织损伤、恶性肿瘤、病理产科、肝脏疾病等其他病因引起的获得性血栓(高凝期)出血(继发低凝、纤溶亢进)综合征。,2DIC的实验室诊断PLT：常减低，通常认为，PLT动态性减低更有助于诊断。PT：延长占7090。Fg：DIC高凝期可增高(大于40gL)，在低凝期和纤溶亢进期常减低FDP：灵敏度达85100，准确性达75。虽然，FDP超过20mgL(肝病时需超过60mgL)才有诊断价值。DIC确诊试验：DD阳性或含量明显增高，是诊断DIC特异性指标，准确率达93；DD阳性也是排除原发性纤溶症的重要试验。总之，DIC实验室诊断中，必须用筛检试验作动态观察，当PLT和Fg进行性减低，而FDP和DD进行性增高时则更有诊断意义。,自动血液凝固分析仪,
