1、第一章 蛋白质化学教学目标：1.掌握蛋白质的概念、重要性和分子组成。2.掌握 -氨基酸的结构通式和 20 种氨基酸的名称、符号、结构、分类；掌握氨基酸的重要性质；熟悉肽和活性肽的概念。3.掌握蛋白质的一、二、三、四级结构的特点及其重要化学键。4.了解蛋白质结构与功能间的关系。5.熟悉蛋白质的重要性质和分类导入：100 年前，恩格斯指出“蛋白体是生命的存在形式” ；今天人们如何认识蛋白质的概念和重要性？ 1839 年荷兰化学家马尔德（G.J.Mulder ）研究了乳和蛋中的清蛋白,并按瑞典化学家 Berzelius 的提议把提取的物质命名为蛋白质（Protein ，源自希腊语，意指 “第一重要的
2、” ） 。德国化学家费希尔 (E.Fischer)研究了蛋白质的组成和结构，在 1907 年奠立蛋白质化学。英国的鲍林(L.Pauling)在 1951 年推引出蛋白质的螺旋；桑格(F.Sanger) 在 1953 年测出胰岛素的一级结构。佩鲁茨(M.F.Perutz)和肯德鲁(J.C.kendrew) 在 1960 年测定血红蛋白和肌红蛋白的晶体结构。1965 年，我国生化学者首先合成了具有生物活性的蛋白质胰岛素（insulin ） 。 蛋白质是由 L- -氨基酸通过肽键缩合而成的，具有较稳定的构象和一定生物功能的生物大分子（biomacromolecule） 。蛋白质是生命活动所依赖的物质
3、基础，是生物体中含量最丰富的大分子。单细胞的大肠杆菌含有 3000 多种蛋白质，而人体有 10 万种以上结构和功能各异的蛋白质，人体干重的 45%是蛋白质。生命是物质运动的高级形式，是通过蛋白质的多种功能来实现的。新陈代谢的所有的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，已发现的酶绝大多数是蛋白质。生命活动所需要的许多小分子物质和离子，它们的运输由蛋白质来完成。生物的运动、生物体的防御体系离不开蛋白质。蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性，以及高等动物的记忆、识别机构等方面都起着重要的作用。随着蛋白质工程和蛋白质组学的兴起和发展，人们对蛋白质的结构与功能的认识越来越深刻。第一节 蛋白质的分子组成一
4、、蛋白质的元素组成经元素分析，主要有 C（50% 55%） 、H（6%7% ） 、O（19% 24%） 、N（13%19%） 、S （0%4%） 。有些蛋白质还含微量的P、Fe 、 Cu、Zn、 Mn、Co、Mo、I 等。各种蛋白质的含氮量很接近，平均为 16%。因此，可以用定氮法来推算样品中蛋白质的大致含量。每克样品含氮克数6.25100=100g 样品中蛋白质含量（g%）二、蛋白质的基本组成单位氨基酸蛋白质在酸、碱或蛋白酶的作用下，最终水解为游离氨基酸（amino acid） ，即蛋白质组成单体或构件分子。存在于自然界中的氨基酸有300 余种，但合成蛋白质的氨基酸仅 20 种（称编码氨基酸
5、） ，最先发现的是天门冬氨酸（1806 年） ，最后鉴定的是苏氨酸（1938 年） 。（一）氨基酸的结构通式组成蛋白质的 20 种氨基酸有共同的结构特点：1氨基连接在 - C 上，属于 -氨基酸（脯氨酸为 - 亚氨基酸） 。2R 是側链，除甘氨酸外都含手性 C，有 D-型和 L-型两种立体异构体。天然蛋白质中的氨基酸都是 L-型。 注意：构型是指分子中各原子的特定空间排布，其变化要求共价键的断裂和重新形成。旋光性是异构体的光学活性，是使偏振光平面向左或向右旋转的性质， （-）表示左旋， （+）表示右旋。构型与旋光性没有直接对应关系。（二）氨基酸的分类1按 R 基的化学结构分为脂肪族、芳香族、杂
6、环、杂环亚氨基酸四类。2按 R 基的极性和在中性溶液的解离状态分为非极性氨基酸、极性不带电荷、极性带负电荷或带正电荷的四类。带有非极性 R（烃基、甲硫基、吲哚环等，共 9 种）：甘（Gly） 、丙（Ala） 、缬（Val ） 、亮（Leu ） 、异亮（Ile） 、苯丙（Phe） 、甲硫（Met ） 、脯（Pro） 、色（Trp）带有不可解离的极性 R（羟基、巯基、酰胺基等，共 6 种）：丝（Ser） 、苏（Thr） 、天胺（Asn） 、谷胺（Gln） 、酪（Tyr） 、半（Cys ）带有可解离的极性 R 基（共 5 种）：天（ Asp） 、谷（Glu） 、赖（Lys） 、精（Arg） 、组（H
7、is ） ，前两个为酸性氨基酸，后三个是碱性氨基酸。蛋白质分子中的胱氨酸是两个半胱氨酸脱氢后以二硫键结合而成，胶原蛋白中的羟脯氨酸、羟赖氨酸，凝血酶原中的羧基谷氨酸是蛋白质加工修饰而成。（三）氨基酸的重要理化性质1一般物理性质-氨基酸为无色晶体，熔点一般在 200 oC 以上。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大（酪氨酸不溶于水） 。一般溶解于稀酸或稀碱，但不能溶解于有机溶剂，通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。芳香族氨基酸（Tyr、Trp 、Phe）有共轭双键，在近紫外区有光吸收能力，Tyr、Trp 的吸收峰在 280nm，Phe 在 265 nm。由于大多数蛋白质含 Tyr、Trp 残基，所
8、以测定蛋白质溶液 280nm 的光吸收值，是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。2两性解离和等电点（isoelectric point, pI）氨基酸在水溶液或晶体状态时以两性离子的形式存在，既可作为酸（质子供体） ，又可作为碱（质子受体）起作用，是两性电解质，其解离度与溶液的 pH 有关。 在某一 pH 的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势和程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的 pH 称为该氨基酸的等电点。氨基酸的 pI 是由 -羧基和 -氨基的解离常数的负对数 pK1 和 pK2 决定的。计算公式为：pI=1/2(pK1+ pK2)。若 1 个氨基酸有 3 个可解离基团，写
9、出它们电离式后取兼性离子两边的 pK 值的平均值，即为此氨基酸的等电点（酸性氨基酸的等电点取两羧基的 pK 值的平均值，碱性氨基酸的等电点取两氨基的 pK 值的平均值） 。3氨基酸的化学反应 氨基酸的化学反应是其基团的特征性反应。重要的有：（1）茚三酮反应所有具有自由 -氨基的氨基酸与过量茚三酮共热形成蓝紫色化合物（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质） 。用分光光度法可定量测定微量的氨基酸。蓝紫色化合物的最大吸收峰在 570nm 波长处，黄色在 440nm 波长下测定。吸收峰值的大小与氨基酸释放的氨量成正比。（2）与 2，4-二硝基氟苯（DNFB）的反应在弱碱性溶液中，氨基酸的 -氨基很
10、容易与 DNFB 作用生成稳定的黄色 2，4-二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸） ，这一反应在蛋白质化学的研究史上起过重要作用，Sanger 等人应用它测定胰岛素一级结构。多肽顺序自动分析仪是根据相类似的原理设计的，即利用多肽链 N 端氨基酸的 -氨基与异硫氰酸苯酯 PITC 反应（Edman 降解法） 。三、肽（peptide ）1肽键与肽链一个氨基酸的 -羧基和另一个氨基酸的 - 氨基脱水形成的酰胺键称为肽键。由氨基酸通过肽键相连而成的化合物称为肽。肽键及其两端的 -碳原子相连所形成的长链骨架，即 CCNC CNCC NC称为多肽主链，CCN是重复单位。肽键是蛋白质分子中的主要共价键。多肽链
11、的方向性是从 N 末端指向 C 末端。肽分子中不完整的氨基酸称为氨基酸残基。肽按其序列从 N 端到 C 端命名。一般 10 肽以下属寡肽，10 肽以上为多肽。2生物活性肽（1）谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由 Glu、Cys、 Gly 组成的一种三肽，又叫 -谷氨酰半胱氨酰甘氨酸（含 - 肽键） 。Cys 的-SH 是主要功能基团，GSH 是一种抗氧化剂，是某些酶的辅酶，可保护蛋白质分子中的-SH 免遭氧化，保护巯基蛋白和酶的活性。在 GSH 过氧化物酶的作用下，GSH 还原细胞内产生的 H2O2，生成 H2O，2 分子 GSH 被氧化成 GSSG，后者在 GSH 还原酶催化下，
12、又生成 GSH。（2）多肽类激素和神经肽人体内有许多激素属寡肽或多肽，如下丘脑垂体分泌的催产素（9 肽） 、加压素（9 肽） 、促肾上腺皮质激素（ACTH，39 肽）等。催产素和加压素结构仅第 3、第 8 位两个氨基酸残基不同，前者使平滑肌收缩，有催产和使乳腺泌乳的作用；后者能使小动脉收缩，增高血压，也有减少排尿的作用。神经肽是在神经传导过程中起信号转导作用的肽类。如脑啡肽（5 肽） 、-内啡肽（31 肽） 、强啡肽（17 肽）等。随着脑科学的发展，会发现更多的生物活性肽。第二节 蛋白质的分子结构蛋白质是生物大分子，结构比较复杂，人们用 4 个层次来描述，包括蛋白质的一级、二级、三级和四级结构
13、。一级结构描述的是蛋白质的线性（或一维）结构，即共价连接的氨基酸残基的序列，又称初级或化学结构。二级以上的结构称高级结构或构象（conformation） 。一、蛋白质的一级结构（primary structure）1953 年，英国科学家 F. Sanger 首先测定了胰岛素（insulin）的一级结构，有 51 个氨基酸残基，由一条 A 链和一条 B 链组成，分子中共有 3 个二硫键，其中两个在 A、B 链之间，另一个在 A 链内。蛋白质的一级结构测定或称序列分析常用的方法是 Edman 降解和重组 DNA 法。Edman 降解是经典的化学方法，比较复杂。首先要纯化一定量的待测蛋白质，分别
14、作分子量测定、氨基酸组成分析、N-末端分析、C-末端分析；要应用不同的化学试剂或特异的蛋白内切酶水解将蛋白质裂解成大小不同的肽段，测出它们的序列，对照不同水解制成的两套肽段，找出重叠片段，最后推断蛋白质的完整序列。重组 DNA 法是基于分子克隆的分子生物学方法，比较简单而高效，不必先纯化该种蛋白质，而是先要得到编码该种蛋白质的基因（DNA片段） ，测定 DNA 中核苷酸的序列，再按三个核苷酸编码一个氨基酸的原则推测蛋白质的完整序列。这两种方法可以相互印证和补充。目前，国际互联网蛋白质数据库已有 3 千多种一级结构清楚。蛋白质一级结构是空间结构和特异生物学功能的基础。二、蛋白质的二级结构（sec
15、ondary structure）蛋白质的二级结构是指其分子中主链原子的局部空间排列，是主链构象（不包括侧链 R 基团） 。构象是分子中原子的空间排列，但这些原子的排列取决于它们绕键的旋转，构象不同于构型，一个蛋白质的构象在不破坏共价键情况下是可以改变的。但是蛋白质中任一氨基酸残基的实际构象自由度是非常有限的，在生理条件下，每种蛋白质似乎是呈现出称为天然构象的单一稳定形状。20 世纪 30 年代末，L.Panling 和 R.B.Corey 应用 X 射线衍射分析测定了一些氨基酸和寡肽的晶体结构，获得了一组标准键长和键角，提出了肽单元（peptide unit）的概念, 还提出了两种主链原子的
16、局部空间排列的分子模型（-螺旋）和（- 折叠） 。1肽单位肽键及其两端的 -C 共 6 个原子处于同一平面上，组成了肽单位（所在的平面称肽键平面） 。肽键 CN 键长为 0.132nm，比相邻的单键（ 0.147nm）短，而较 C=N 双键（0.128nm）长，有部分双键的性质，不能自由旋转。肽键平面上各原子呈顺反异构关系，肽键平面上的 O、H 以及 2 个 - 碳原子为反式构型（trans configuration） 。主链中的 CC 和 CN 单键可以旋转，其旋转角 、 决定了两个相邻的肽键平面相对关系。由于肽键平面的相对旋转，使主链可以以非常多的构象出现。事实上，肽链在构象上受到很大限
17、制，因为主链上有 1/3 不能自由旋转的肽键，另外主链上有很多侧链R 的影响。蛋白质的主链骨架由许多肽键平面连接而成。2.-螺旋( -helix) -螺旋是肽键平面通过 -碳原子的相对旋转形成的一种紧密螺旋盘绕，是有周期的一种主链构象。其特点是： 螺旋每转一圈上升 3.6 个氨基酸残基，螺距约 0.54nm（每个残基上升 0.15nm，旋转 100O） 。 相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行。典型 -螺旋一对氢键 O 与 N 之间共有 13 个原子（3.613） ，前后间隔3 个残基。螺旋的走向绝大部分是右手螺旋，残基侧链伸向外侧。R 基团的大小、荷电状态及形状均对 -螺旋
18、的形成及稳定有影响。3.-折叠( -pleated sheet) -折叠是一种肽链相当伸展的周期性结构。 相邻肽键平面间折叠成 110O 角，呈锯齿状。 两个以上具 -折叠的肽链或同一肽链内不同肽段相互平行排列，形成 - 折叠片层，其稳定因素是肽链间的氢键。 逆向平行的片层结构比顺向平行的稳定。-螺旋和 - 折叠是蛋白质二级结构的主要形式。毛发中的 -角蛋白和蚕丝中的丝心蛋白是其典型，在许多球蛋白中也存在，但所占比例不一样。胶原蛋白中存在的螺旋结构不同于一般的 -螺旋，是由 3 条具有左手螺旋的链相互缠绕形成右手超螺旋分子。链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持其稳定性。4-转角（-turn
19、）为了紧紧折叠成球蛋白的紧密形状，多肽链 180O 回折成发夹或 -转角。其处由 4 个连续的氨基酸残基构成，常有 Gly 和 Pro 存在，稳定 - 转角的作用力是第一个氨基酸残基羰基氧（ O）与第四个氨基酸残基的氨基氢（H）之间形成的氢键。- 转角常见于连接反平行-折叠片的端头。5无规卷曲（random coil）多肽链的主链呈现无确定规律的卷曲。典型球蛋白大约一半多肽链是这样的构象。6超二级结构和结构域超二级结构和结构域是蛋白质二级至三级结构层次的一种过渡态构象。超二级结构指蛋白质中两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一特殊的组合体，又称为模体（motif） 。通常有， 等
20、，例如钙结合蛋白质中的螺旋-环- 螺旋模序及锌指结构。结构域是球状蛋白质的折叠单位，是在超二级结构基础上进一步绕曲折叠有独特构象和部分生物学功能的结构。对于较小的蛋白质分子或亚基，结构域和三级结构是一个意思，即这些蛋白质是单结构域的；对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上的相对独立的结构域缔合成三级结构。三、蛋白质的三级结构（tertiary structure）指一条多肽链中所有原子的整体排布，包括主链和侧链。维系三级结构的作用力主要是次级键（疏水相互作用、静电力、氢键等） 。在序列中相隔较远的氨基酸疏水侧链相互靠近，形成“洞穴”或“口袋”状结构，结合蛋白质的辅基往往镶嵌其内
21、，形成功能活性部位，而亲水基团则在外，这也是球状蛋白质易溶于水的原因。1963 年 Kendrew 等从鲸肌红蛋白的 X 射线衍射图谱测定它的三级结构（153 个氨基酸残基和一个血红素辅基，相对分子质量为 17800） 。由 AH 8 段 -螺旋盘绕折叠成球状，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部形成一个袋形空穴，血红素居于其中，富有极性及电荷的则在分子表面形成亲水的球状蛋白。四、蛋白质的四级结构 (quaternary structure)有些蛋白质的分子量很大，由 2 条或 2 条以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成，称为蛋白质的四级结构。构成四级结构的每条多肽链称为亚基
22、(subunit)，亚基单独存在时一般没有生物学功能，构成四级结构的几个亚基可以相同或不同。如血红蛋白(hemoglobin,Hb) 是由两个 -亚基和两个 -亚基形成的四聚体（22） 。五、蛋白质分子中的化学键蛋白质的一级结构是由共价键形成的，如肽键和二硫键。而维持空间构象稳定的是非共价的次级键。如氢键、盐键、疏水键、范德华引力等。第三节 蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系（一）一级结构是空间构象的基础 20 世纪 60 年代初，美国科学家 C.Anfinsen 进行牛胰核糖核酸酶的变性和复性实验，提出了蛋白质一级结构决定空间结构的命题。核糖核酸酶由 124 个氨基酸残基组
23、成，有 4 对二硫键。用尿素和 -巯基乙醇处理该酶溶液，分别破坏次级键和二硫键，肽链完全伸展，变性的酶失去催化活性；当用透析方法去除变性剂后，酶活性几乎完全恢复，理化性质也与天然的酶一样。概率计算表明，8 个半胱氨酸残基结合成 4 对二硫键，可随机组合成 105 种配对方式，而事实上只形成了天然酶的构象，这说明一级结构未破坏，保持了氨基酸的排列顺序就可能回复到原来的三级结构，功能依然存在。（二）种属差异大量实验结果证明，一级结构相似的多肽或蛋白质，其空间结构和功能也相似，不同种属的同源蛋白质有同源序列，反映其共同进化起源，通过比较可以揭示进化关系。例如哺乳动物的胰岛素，其一级结构仅个别氨基酸差
24、异（A 链 5、6、10 位，B 链 30 位） ，它们对生物活性调节糖代谢的生理功能不起决定作用。从各种生物的细胞色素 C(cytochrome c ) 的一级结构分析，可以了解物种进化间的关系。进化中越接近的生物，它们的细胞色素 c 的一级结构越近似。（三）分子病分子病是指机体 DNA 分子上基因缺陷引起 mRNA 分子异常和蛋白质生物合成的异常，进而导致机体某些功能和结构随之变异的遗传病。在 1904 年，发现镰刀状红细胞贫血病。大约化费了 40 多年才清楚患病原因，患者的血红蛋白（HbS）与正常人的（HbA）相比，仅 -链的第 6 位上，Val 取代了正常的 Glu。目前全世界已发现有
25、异常血红蛋白 400 种以上。二、蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础，空间结构变化，其功能也随之改变。肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是典型的例子。肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）都能与氧进行可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而 Hb 是四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储存氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散。它们的氧合曲线不同，Mb 为一条双曲线，Hb 是一条 S 型曲线。在低 p(O2)下，肌红蛋白比血红蛋白对氧亲和性高很多，p(O2)为 2.8torr(1torr133.3Pa)时，肌红蛋白处于半饱和状态。在高 p(O2)下，如在肺部（大约100
26、torr）时，两者几乎都被饱和。其差异形成一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。Hb 未与氧结合时，其亚基处于一种空间结构紧密的构象（紧张态，T 型） ，与氧的亲和力小。只要有一个亚基与氧结合，就能使 4 个亚基间的盐键断裂，变成松弛的构象（松弛态，R 型） 。T 型和 R 型的相互转换对调节 Hb 运氧的功能有重要作用。一个亚基与其配体结合后能促进另一亚基与配体的结合是正协同效应，其理论解释是 Hb 是别构蛋白，有别构效应。第四节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质和氨基酸相似，有两性解离及等电点、紫外吸收和呈色反应。作为生物大分子，还有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。要了解和分析蛋白质
27、结构和功能的关系就要利用其特殊的理化性质，采取盐析、透析、电泳、层析及离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法分离纯化蛋白质。一、蛋白质的高分子性质蛋白质的相对分子质量在 1 万100 万，其颗粒平均直径约为 4.3 nm（胶粒范围是 1100nm） 。准确可靠的测定方法是超离心法，蛋白质的相对分子质量可用沉降系数（S）表示。在球状蛋白质三级结构形成时，亲水基团位于分子表面，在水溶液中与水起水合作用，因此，蛋白质的水溶液具有亲水胶体的性质。颗粒表面的水化膜和电荷是其稳定的因素，调节 pH 至 pI、加入脱水剂等，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。透析法是利用蛋白质不能透过半透膜的性质，去掉小分子物质，达
28、到纯化的目的。大小不同的蛋白质分子可以通过凝胶过滤分开。又称分子筛层析。二、蛋白质的两性解离蛋白质和氨基酸一样是两性电解质，在溶液中的荷电状态受 pH 值影响。当蛋白质溶液处于某一 pH 时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为该蛋白质的等电点。pHpI 时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。在人体体液中多数蛋白质的等电点接近 pH5，所以在生理 pH7.4 环境下，多数蛋白质解离成阴离子。少量蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白的 pI 偏于碱性，称碱性蛋白质，而胃蛋白酶和丝蛋白为酸性蛋白。三、蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质在某些理化因素的作用下，空
29、间结构被破坏，导致理化性质改变，生物学活性丧失，称为蛋白质的变性（denaturation） 。蛋白质变性的本质是多肽链从卷曲到伸展的过程，不涉及一级结构的改变（如加热破坏氢键，酸碱破坏盐键等） 。变性作用不过于剧烈，是一种可逆反应，去除变性因素，有些蛋白质原有的构象和功能可恢复或部分恢复，称为复性（denaturation） 。蛋白质变性的主要表现是失去生物学活性，如酶失去催化能力、血红蛋白失去运输氧的功能、胰岛素失去调节血糖的生理功能等。变性蛋白溶解度降低，易形成沉淀析出；易被蛋白水解酶消化。蛋白质变性具有重要的实际意义。蛋白质自溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。盐析、有机溶剂、重金属盐
30、、生物碱试剂都可沉淀蛋白质。盐析沉淀蛋白质不变性，是分离制备蛋白质的常用方法。如血浆中的清蛋白在饱和的硫酸铵溶液中可沉淀，而球蛋白则在半饱和硫酸铵溶液中发生沉淀。乙醇、丙酮均为脱水剂，可破坏水化膜，降低水的介电常数，使蛋白质的解离程度降低，表面电荷减少，从而使蛋白质沉淀析出。低温时，用丙酮沉淀蛋白质，可保留原有的生物学活性。但用乙醇，时间较长则会导致变性。重金属盐（Hg2+、Cu2+ 、Ag+） ，生物碱（如三彔乙酸、苦味酸、鞣酸）与蛋白质结合成盐而沉淀，是不可逆的。蛋白质变性不一定沉淀（如强酸、强碱作用变性后仍然能溶解于强酸、强碱溶液中，将 pH 调至等电点，出现絮状物，仍可溶解于强酸、强碱
31、溶液，加热则变成凝块，不再溶解） 。凝固是蛋白质变性发展的不可逆的结果。沉淀的蛋白质不一定变性（如盐析） 。四、蛋白质的紫外吸收和呈色反应蛋白质含芳香族氨基酸，在 280nm 波长处有特征性吸收峰，用于定量测定。蛋白质分子中的多种化学基团具有特定的化学性能，与某些试剂产生颜色反应，可用于定性、定量分析。如蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，在碱性溶液与硫酸铜反应产生红紫色络合物（双缩脲反应） 。酪氨酸含酚基，与米伦试剂生成白色沉淀，加热后变红色。Folin-酚试剂与酪氨酸反应生成蓝色。色氨酸与乙醛酸反应，慢慢注入浓硫酸，出现紫色环。第五节 蛋白质的分类自然界蛋白质分布广泛，种类繁多，有
32、 10121013 种。目前仍无法按蛋白质的化学结构进行精确的分类，一般按蛋白质的分子形状、分子组成、生物功能进行分类。1按分子形状分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。2按分子组成分为简单蛋白质和结合蛋白质。简单蛋白质完全水解的产物仅为 -氨基酸。这类蛋白质按其溶解度等理化性质分为 7 类。包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白和硬蛋白。结合蛋白质由简单蛋白质和非蛋白质（辅基）组成。根据辅基的不同，这类蛋白质可分为 5 类。如核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和磷蛋白。细胞核中的核蛋白是 DNA 与组蛋白结合而成，细胞质中的核糖体是 RNA 与蛋白质组成的，已知的病毒也是核蛋白。免疫球蛋白
33、是一类糖蛋白，由蛋白质与糖以共价键相连而成；脂蛋白由蛋白质与脂类通过非共价键相连，存在生物膜和动物血浆中。3按蛋白质功能分为活性蛋白质和非活性蛋白质。活性蛋白质包括有催化功能的酶、有调节功能的激素、有运动、防御、接受和传递信息的蛋白质以及毒蛋白、膜蛋白等。胶原、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等是非活性蛋白质。第二章 核酸的化学教学目标：1.掌握 DNA 和 RNA 在化学组分、分子结构和生物功能上的特点。2.掌握 DNA 双螺旋结构模型和 t-RNA 二级结构的要点，了解核酸的三级结构。3.熟悉核酸的性质（一般性质、DNA 热变性、复性与分子杂交） 。4.掌握基因组的概念，原核生物和真核生物基因组
34、的特点。了解 DNA 测序的原理。导入：核酸是生物遗传的物质基础。它的发现和研究进展如何？1868 年瑞士青年医生 Miescher 从脓细胞核中分离出一种含磷量很高的酸性化合物，称为核素。其继任者 Altman 发展了从酵母和动物组织中制备不含蛋白质的核酸的方法，于 1889 年提出核酸（nucleic acid）这一名称。早期核酸研究因“四核苷酸假说”的错误进展缓慢。1943 年 Chargaff 等揭示了 DNA 的碱基配对规律，1944 年美国 Avery 利用致病肺炎球菌中提取的 DNA 使另一种非致病性的肺炎球菌的遗传性状发生改变而成为致病菌，发现正是 DNA 携带遗传信息。Ast
35、bury、Franklin 和 Wilkins 用 X 射线衍射法研究 DNA 分子结构，得到清晰衍射图。Watson 和 Crick 在此基础上于 1953 年提出了 DNA 双螺旋结构模型，说明了基因结构、信息和功能三者之间的关系，奠定了分子生物学基础。1958 年 Crick 提出“中心法则” ；60 年代破译遗传密码，阐明 3 类 RNA 参与蛋白质生物合成的过程；70 年代诞生了基因重组和 DNA 测序生物技术，90 年代提出人类基因组计划，21 世纪进入后基因组时代。核酸的研究成了生命科学中最活跃的领域之一。第一节 核酸的化学组成天然存在的核酸有两类，即脱氧核糖核酸（deoxyri
36、bonucleic acid，DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid，RNA） 。DNA 分子是生物体的遗传信息库，分布在原核细胞的核区，真核细胞的核和细胞器以及病毒中；RNA 分子参与遗传信息表达的一些过程，主要存在于细胞质。一、核酸的基本组成单位核酸是一种多聚核苷酸，用不同的降解法得到其组成单位核苷酸。而核苷酸又由碱基、戊糖和磷酸组成。（一） 戊糖 DNA 含 -D-2- 脱氧核糖， RNA 含 -D- 核糖。这是核酸分类的依据。核糖中的 C 记为 15。（二）碱基（base） 核酸中的碱基有两类：嘌呤碱和嘧啶碱。有 5 种基本的碱基外，还有一些含量甚少的稀有碱基。DNA 和
37、 RNA 中常见的两种嘌呤碱是腺嘌呤（adenine，A） 、鸟嘌呤（ guanine，G） 。而嘧啶碱有所不同：RNA 主要含胞嘧啶（cytosine ，C） 、尿嘧啶（uracil ，U） ，DNA 主要含胞嘧啶、胸腺嘧啶（thymine，T） 。tRNA 中含有较多的稀有碱基（修饰碱基） ，多为甲基化的。（三）核苷是碱基和戊糖生成的糖苷。通过 C1- N9 或 C1- N1 糖苷键连接，用单字符表示，脱氧核苷则在单字符前加 d。常见的修饰核苷有：次黄苷或肌苷为 I、黄嘌呤核苷 X、二氢尿嘧啶核苷 D、假尿苷 等。注意符号的意义，如 m5dC。（四）核苷酸是核苷的磷酸酯。生物体内游离存在的
38、多是 5- 核苷酸（如 pA、pdG 等） 。常见的核苷酸为 AMP、GMA 、CMP 、UMP。常见的脱氧核苷酸有 dAMP、dGMA、 dCMP、dTMP。AMP 是一些重要辅酶的结构成分（如 NAD+、NADP+、FAD 等） ；环化核苷酸（cAMP/cGMP）是细胞功能的调节分子和信号分子。ATP 在能量代谢中起重要作用。核苷酸是两性电解质，有等电点。核苷酸有互变异构和紫外吸收。 （含氧的碱基有酮式和烯醇式两种互变异构体，在生理 pH 条件下主要以酮式存在）二、核苷酸的连接方式RNA 和 DNA 链都有方向性，从 5 3。前一位核苷酸的 3- OH 与下一位核苷酸的 5位磷酸基之间形成
39、 3，5- 磷酸二酯键，从而形成一个没有分支的线性大分子，两个末端分别称为 5末端和 3末端。大分子的主链由相间排列的戊糖和磷酸构成，而碱基可看作主链上的侧链基团，主链上的磷酸基是酸性的，在细胞 pH 下带负电荷；而碱基有疏水性。讨论：列表说明 DNA 和 RNA 在化学组成、分子结构和生物功能方面的主要特点。第二节 DNA 的分子结构一、 DNA 的一级结构 (primary stucture)DNA 的一级结构是指分子中脱氧核苷酸的排列顺序，常被简单认为是碱基序列（base sequence） 。碱基序有严格的方向性和多样性。一般将 5- 磷酸端作 为多核苷酸链的 “头” ，写在左侧，如
40、pACUGA（ 5 3） 。 在 DNA 一级结构中，有一种回文结构的特殊序列，所谓回文结构即 DNA 互补链上一段反向重复顺序，正读和反读意义相同，经反折可形成“十字形”结构，在转录成 RNA 后可形成“发夹”样结构，有调控意义。 GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT CGAT CAAGT GAG ACTTG TTAA DNA 分子很大，最小的病毒 DNA 约含 5000b。1965 年 Holley 用片段重叠法完成酵母 tRNAala 76nt 序列测定；1977 年 Sanger 利用双脱氧法（酶法）测定了 X174 单链 DNA5386b 的全序列。1990 年实施的人
41、类基因组计划（HGP） ，用 15 年，投资 30 亿美元，完成人类单倍体基因组 DNA3109bp 全序列的测定。该计划由美、英、日、法、德、中六国科学家合作，于 2003 年提前完成，生命科学进入后基因组时代，研究重点从测序转向对基因组功能的研究。二、DNA 的二级结构双螺旋(double helix) 1953 年，Watson 和 Crick 根据 Wilkins 和 Franklin 拍摄的 DNA X-射线照片（DNA 有 0.34nm 和 3.4nm 两个周期性变化）以及Chargaff 等人对 DNA 的碱基组成的分析（A=T，G=C，A+G=C+T ） ，推测出 DNA 是由
42、两条相互缠绕的链形成。Watson-Crick 双螺旋结构模型如下图：1两条反向平行的多核苷酸链形成右手螺旋。一条链为 5 3，另一条为 3 5。 （某些病毒的 DNA 是单链分子ssDNA）2碱基在双螺旋内侧，A 与 T，G 与 C 配对，A 与 T 形成两个氢键，G 与 C 形成三个氢键。糖基- 磷酸基骨架在外侧。表面有一条大沟和一小沟。3螺距为 3.4 nm，含 10 个碱基对（bp） ，相邻碱基对平面间的距离为 0.34 nm。螺旋直径为 2 nm。氢键维持双螺旋的横向稳定。碱基对平面几乎垂直螺旋轴，碱基对平面间的疏水堆积力维持螺旋的纵向稳定。4碱基在一条链上的排列顺序不受限制。遗传信
43、息由碱基序所携带。5DNA 构象有多态性。Watson 和 Crick 根据 Wilkins 和 Franklin 拍摄的 DNA X-射线照片是相对湿度 92%的 DNA 钠盐所得的衍射图，因此 Watson-Crick 双螺旋结构称 B-DNA。细胞内的 DNA 与它非常相似。另外还有 A-DNA、C-DNA、D-DNA。1979 年 Rich 发现 Z-DNA（左手螺旋、螺距 4.5nm、直径 1.8nm）三、DNA 的三级结构DNA 双螺旋进一步盘曲所形成的空间构象称 DNA 的三级结构。某些病毒、细菌、真核生物线粒体和叶绿体的 DNA 是环形双螺旋，再次螺旋化形成超螺旋；在真核生物细
44、胞核内的 DNA 是很长的线形双螺旋，通过组装形成非常致密的超级结构。 1环形 DNA 可形成超螺旋 当将线性过旋或欠旋的双螺旋 DNA 连接形成一个环时，都会自动形成额外的超螺旋来抵消过旋或欠旋造成的应力，目的是维持 B 构象。过旋 DNA 会自动形成额外的左手螺旋（正超螺旋） ，而欠旋形成额外的右手螺旋（负超螺旋） 。一段双螺旋圈数为 10 的 B-DNA 连接成环形时，不发生进一步扭曲，称松弛环形 DNA（双螺旋的圈数= 链绕数，即 T=L，超螺旋数W=0；L=T+W） ，但将这一线形 DNA 的螺旋先拧松一圈再连接成环时，解链环形 DNA 存在的扭曲张力，可导致双链环向右手方向扭曲形成
45、负超螺旋（T10，L=9，W = -1） 。在生物体内，绝大多数超螺旋 DNA 以负超螺旋的形式存在，也就是说，一旦超螺旋解开，则会形成解链环形 DNA，有利于 DNA 复制或转录。螺旋具有相同的结构，但 L 值不同的分子称为拓扑异构体。DNA 拓扑异构酶切断一条链或两条链，拓扑异构体可以相互转变。W 的正表示双链闭环的螺旋圈在增加，W 的负表示减少。L 和 T 的正负表示螺旋方向，右手为正，左手螺旋为负；L 值必定是整数。2真核细胞染色体 真核细胞 DNA 是线形分子，与组蛋白结合，其两端固定也形成超螺旋结构。DNA 被紧密地包装成染色体来自三个水平的折叠：核小体、30nm 纤丝和放射环。核
46、小体是染色体的基本结构单位，是 DNA 包装的第一步，它由 DNA 结合到组蛋白上形成复合物，在电镜下显示为成串的“念珠”状。组蛋白是富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白质，其氨基酸序列在进化中是高度保守的。组蛋白有 5 种，H2A、H2B、H3 和 H4 各两分子组成的八聚体是核小体核心颗粒，DNA 缠绕其上，相邻核小体间的 DNA 称为连接 DNA 且结合 H1。200 bpDNA 的长度约为 68nm，被压缩在 10nm 的核小体中。压缩比约为 7。30nm 纤丝是第二级压缩，每圈含 6 个核小体，压缩比是 6。30nm 螺旋管再缠绕成超螺旋圆筒，压缩比是 40。再进一步形成染色单体，总压缩近一
47、万倍。典型人体细胞的 DNA 理论长度应是 180 cm，被包装在 46 个 5m 的染色体中。四、DNA 和基因组1DNA 分子中的最小功能单位称作基因，为 RNA 或蛋白质编码的基因称结构基因，DNA 中具调节功能而不转录生成 RNA 的片段称调节基因。基因组（genome）是某生物体所含的全部基因，即全部 DNA 或完整的单套遗传物质（配子中的整套基因） 。2细菌、噬菌体、大多数动植物病毒的基因组即指单个 DNA 分子。最小病毒如 SV40 的基因组仅有 5226b，含 5 个基因。大肠杆菌含 4.6106 bp，有 30004000 个基因，DNA 完全伸展总长约 1.3mm。原核生物
48、基因组的特点是：结构简炼，绝大部分为蛋白质编码（结构基因） ；有转录单元，即功能相关的基因常串联一起，并转录在同一 mRNA（多顺反子 mRNA）中；有基因重叠现象，即同一段 DNA 携带两种不同蛋白质的信息。3真核生物基因一般分布在若干条染色体上，其特点是：有重复序列（按重复次数分单拷贝序、中度重复序和高度重复序） ；有断裂基因（由不编码的内含子和编码的外显子组成） 。酵母基因组有 1.35107bp，含 6374 个基因。人类基因组有 3109 bp，含 4 万个基因。第三节 RNA 的分子结构RNA 通常以单链形式存在，比 DNA 分子小得多，由数十个至数千个核苷酸组成。RNA 链可以回折且通过 A 与 U，G 与 C 配对形成局部的双螺旋，不能配对的碱基则形成环状突起，这种短的双螺旋区和环称为发夹结构。 RNA 的 C2位羟基是游离的，是一个易发生不良反应的位置，它使 RNA 的化学性质不如 DNA 稳定，能较 DNA 产生更多的修饰组分。RNA 的种类、大小、结构都比 DNA 多样化，按照功能的不同和结构的特点，RNA 主要分为 tRNA、rRNA 和 mRNA 三类。此外，细胞的不同部位还存在着另一些小分子 RNA，如核内小 RNA（snRNA） 、核仁小
