1、第三章 血栓与止血检测,Questions：（1）生理状态下, 血管中流动的血液为什么不凝固?（2）损伤出血后为什么能止血?,促凝与抗凝平衡紊乱的两种类型,正常凝血-抗凝平衡,凝血亢进，抗凝或纤溶减弱,凝血低下，抗凝或纤溶增强,血栓形成,出血倾向,正常止血凝血机能,两个方面,五个因素,凝血机制-防止出血不止,抗凝机制-防止血栓形成,血管壁（vessel wall）,血小板（platelet）,凝血系统（coagulation system）,抗凝（anticoagulation）纤溶系统（fibrinolysis）,凝血与抗凝机制的病理生理基础,止血与凝血简要机理,1.血管壁：血管收缩、血流减
2、慢2.血小板: 粘附、聚集、释放、促凝、收缩、血小板栓(白色栓子)3.凝血系统：内源和外源激活 （红色栓子）4.抗凝系统：AT抑制内外源途径凝血因子4. 纤溶激活：血块自溶，血管修复,血小板激活一次血栓形成,血管収縮,凝固因子激活二次血栓形成,纤溶系统激活血栓溶解,止、凝血过程,内皮細胞,血管収縮,血管収縮,血管損傷(出血),血小板,血小板,7,Body defenses against Thrombosis,TFPIZPI,AT IIIHCoIIPC/PS/TM,Fibrinolyse,Blood activation markers,Activation,Thrombus,Plt,Plt,
3、Plt,Plt,BTG, PF4, TBSP, ,TAT, F1-2,EC,EC,EC,EC,TM,DD, FDP, fdp,FM, PAP,PAI-1,u-PA,PAI-1,(active),u-PA,PAI-1/u-PAPAI-1/t-PA,PAI-1,(active),t-PA,Plasminogen,Plasmin,Cross-Linked Fibrin,Cross-Linked Fibrin Degradation Products, 2-Antiplasmin,D-dimer,D-dimer-E,PAI-1,t-PA,纤溶系统活化机制,一、血管壁作用,（一）血管壁的止血作用 1.血
4、管壁的完整性,是防止出血的重要保证 血管内皮细胞之间及内皮下胶原 与Vit c有关 血小板参与血管壁的完整性和维持通透性,血管壁完整性破坏的出血机制,当Vit c 缺乏或plt 减少时，管壁抵抗力下降,内皮细胞间隙增大,脆性、通透性增加,RBC及血液成分外溢,出血,良好的弹力纤维-保持血管壁的柔韧性健全的神经纤维-维持血管壁的舒缩性带负电荷的胶原纤维-PLT粘附和启动凝血过程（）,2. 血管内皮下层,3. 血管内皮细胞产生,Von Willebrand Factor vWF (vW 因子)Fibronectin Fn (纤维结合蛋白)Tissue Factor TF (组织因子 FIII)En
5、douthelin ET (内皮素),当血管壁受损后的一系列变化,.神经反射,管腔收缩,血流变慢,出血/停止,.内皮细胞分泌vWF、Fn,促进plt粘附,.释放FIII,启动外源性凝血途径,.暴露内皮下胶原,促进血小板粘附启动内源性凝血途径,（二）正常血管壁抗血栓形成能力,血管内皮细胞合成：前列环素I2(PGI2) 扩张血管、抑制plt聚集纤溶酶原激活物(PA) 激活纤溶酶原、清除小凝块 血栓调节素(thrombomodulin TM) 参与蛋白C系统的抗凝作用硫酸乙酰肝素或类肝素物质 具有多种抗凝活性,创伤、炎症中毒、缺氧,管壁抗凝作用病理性血栓形成,（一）静态下血小板形态 蛋白质 glyc
6、oprotein GP 如：GPIa Ib IIb a 代谢产生花生四烯酸、血栓烷A2 磷脂 (TXA2 )、血小板活化因子等 提供催化表面（PF3）,二、血小板在止血机能中的作用, 包膜,膜下：微管与微丝框架 维持形态、变形 活化胞浆：肌球、肌动蛋白 血凝块缩小、加固三种特殊颗粒： -颗粒、致密颗粒、溶酶体,1.粘附功能（adhesion function） 指血小板具有粘附于血管内皮下胶原及其他异物表面的能力 需要物质GPIb-vWF III型胶原纤维结合蛋白（Fn）,（二）血小板功能,指活化后的血小板与血小板之间相互连接的特性 参加因素GPIIb/IIIa纤维蛋白原钙离子聚集诱导剂： A
7、DP、肾上腺素、TXA2、花生四烯酸,2.聚集功能（aggregation function）,IIb,IIb,粘附与聚集的结果,血小板大量粘附、聚集于血管破损处,形成白色血栓,暂时止血,3释放功能 ：(release reaction),指血小板在诱导剂的作用下，将胞浆内特殊颗粒中的内含物释放出血小板的反应 -颗粒 致密颗粒 溶酶体 与血小板粘附、聚集、炎症反应、创伤修复动脉粥样硬化等作用有关,4血块收缩功能,血凝块,血小板血栓收缩蛋白,纤维蛋白网 收缩,血清被挤出血块缩小加固,PL（PF3）提供凝血因子催化表面,5血小板促凝活性,血小板止血功能, 维持血管壁的完整性，毛细血管的通透性。 粘
8、附、聚集在血管破损处，形成白色血栓。 释放活性物质，促进血小板二次聚集，增强 血管收缩。 促进凝血过程。 血块收缩，形成稳固血栓。,三、凝血因子与凝血过程,血液由流动状态变为凝胶状态称血液凝固。是由一系列凝血因子及血小板等参加的、复杂 的酶促反应和分子聚合过程,分为三个阶段，两个途径（内源性、外源性）,第一阶段：凝血酶原激活物形成第二阶段：凝血酶形成第三阶段：纤维蛋白形成,目前公认的凝血因子共14个，按罗马字命名的有12个，尚有高分子量激肽原(HMWK)，激肽释放酶原(PK)。大多数由肝脏产生，其中II、VII、IX、X合成依赖于Vitk，称Vitk依赖因子。正常情况下，所有因子都处于无活性状
9、态（酶原）。,FVII(a),血管损伤,TF,TF-VIIa-Ca+,表面接触,FXII,FXIIa,FXI,FXIa,HMWK,FIX,FIXa,FVIIIa,FVIII,Ca+,PL,Ca+,FXa,FVa,Ca+,PL,FX,FII,FIIa,FV,Fg,Fb,FXIIIa,Ca+,FXIII,外源凝血系统,内源凝血系统,传统凝血机制,凝血的三个阶段,FXII,FXI,FIX,FX,FVII,TF,凝血酶原,纤维蛋白原,Ca+,FV,PF3,第一阶段,第二阶段,第三阶段,内源性,外源性,凝血酶,Ca+,F,PF3,纤维蛋白单体,交联的纤维蛋白,FX,APTT,TT,PT,XII,XI,I
10、X,VIII,VII,X,V,II,I,四 、正常抗凝及纤溶系统,（一）细胞抗凝机制,单核-巨噬细胞,吞 噬清 除,凝血过程有关 物质和产物,（二）体液抗凝机制,血液中存在多种抗凝物质及抗凝系统 1抗凝血酶（antithrombin，AT） AT 灭活IIa、a 、IXa、 Xa、 XIIa、激肽释放酶,肝素,2. 组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor TFPI),a,a,TFPI,灭活a、TF、a,TF,a,3. 蛋白C系统,蛋白C（Protein C, PC）蛋白S（PS）血栓调节素（thrombomodulin, TM）活化蛋白C抑制物(ac
11、tivated protein C inhibitor, APCI ，即PAI3),血管内皮细胞PC受体/PE,蛋白C,蛋白Ca,凝血酶 +,血栓调节素,PAI3,灭活Va、a,激活纤溶系统,血管内皮细胞,蛋白C系统抗凝机制,4、肝素：硫酸粘多糖类物质，主要由肺和肠粘膜肥大细胞合成 主要抗凝作用：抗FXa及凝血酶 抗凝机制：与AT密切相关 肝素与AT结合AT构型变化（活性中心暴露）与FXa或凝血酶结合成复合物（1:1）灭活FXa及凝血酶（增强约2000倍） 促进内皮释放t-PA，纤溶活性,凝血的三个阶段,FXII,FXI,FIX,FX,FVII,TF,凝血酶原,纤维蛋白原,Ca+,FV,PF3
12、,第一阶段,第二阶段,第三阶段,内源性,外源性,凝血酶,Ca+,F,PF3,纤维蛋白单体,交联的纤维蛋白,FX,AT-,蛋白C系统,TFPI,与抗凝系统,（三）纤维蛋白溶解系统（fibrinolysis，纤溶系统）,主要作用：分解纤维蛋白（原），清除血管内由于纤维蛋白沉积引起的阻塞，保持血流通畅,最重要的生理性抗凝系统,XIIa PK,纤溶酶原,纤溶酶,u-PA t-PA,纤维蛋白溶解系统组成与激活,纤溶酶原（PLG）,纤溶酶（PL）,纤维蛋白原纤维蛋白单体交联的纤维蛋白,纤维蛋白降解产物(FDP),t-PA,u-PA,激肽释放酶 （内源性凝血途径）,（一）纤溶酶原激活的途径（有三条激活途径）
13、 （1）内激活途径 PK K tcu-PA（双） PLG PL 此是继发性纤溶的理论基础,FXIIaHMWK,scu-PA（单）,纤维蛋白溶解机制,（2）外激活途径 PLG PL 此是原发性纤溶的理论基础。,u-PA,t-PA,vEC,nEC,血管,肾小球,PAI1、PAI2,（3）外源激活途径 外界进入体内的溶栓药物如： SK、UK、rt-PA PLG PL 此为溶栓治疗的理论基础。,SK、UK,rt-PA,纤维蛋白(原)的降解机制,纤维蛋白原,非交联纤维蛋白,交联纤维蛋白,纤溶酶,纤溶酶,纤溶酶,X、Y、D、E,B 1-42,A、B、C、H,X、Y、D、E,B 15-42,A、B、C、H,
14、X、Y、D、E,D二聚体,DD-E聚合物等,凝血酶,FXIIIa,FPA、FPB,止凝血障碍性疾病的发病机制,血管壁结构与功能异常血小板质与量异常凝血因子质与量异常抗凝及纤溶系统异常循环中凝血及抗凝物质增加血液流变性改变等综合因素,血栓与止血的实验检查,第一节 血管壁检查,筛查试验：出血时间（bleeding time,BT）,【原 理】 测定毛细血管被刺破后至自然止血所需时间，主要反映血管壁和血小板相互作用。,【方 法】,用标准弹簧针或刀片刺破皮肤2-3mm深，观察出血自然停止的时间。【参考范围】 Duke法 1-3 min 4min为延长 Ivy 法 2-6min 7min为延长 BT测定
15、器法 6.92.1min 9min为延长,【临床意义】,1. BT长短主要受血小板因素（数量和功能）和血管壁（脆性和通透性）因素的影响,2. BT延长血小板明显减少：如原发性或继发性血小板减 少性紫癜; 血小板功能异常：如血小板无力症和巨大血小板综合征 某些凝血因子严重缺乏：如vWD、DIC；血管异常（罕见）：如遗传性血管周围结缔组织病; 药物干扰：如服用阿司匹林、肝素、rt-PA等。 临床价值有限,3BT缩短 某些严重高凝状态或血栓性疾病 DIC高凝期,【应用评价】BT是筛查血小板与血管相互作用的较敏感指标，通常采用出血时间测定器测定。BT操作复杂，切口大，一般不作为常规筛查，对有皮肤、黏膜
16、出血，怀疑初期止血缺陷者可检查BT。检查前一周应停用抗血小板药物。,确诊试验：血管性血友病因子（VWF）,vWF是血管内皮细胞合成和分泌的促凝物质。vWF是血小板粘附和聚集的物质基础。vWF是检测血管损伤和功能减低的金标准。,1. vWF:Ag测定【原理】 vWF:Ag + 乳胶包被McAb 免疫比浊法 浓度与浊度呈正相关,【临床意义】 （1）vWF:Ag减低 见于 VWD，是诊断vWD及其分型的指标（2）增高 见于可导致血管内皮细胞损伤的疾病，主要是血栓性疾病（动、静脉，微静脉）。,2. vWF:A测定 【 原理】 vWF（ 含GpIb受体 ）+乳胶包被抗GpIb 浊度与GpIb受体呈正相关
17、 （即vWF：A与浊度呈正相关）,【临床意义】 vWF:A主要与vWF:Ag和FVIII:C结合，用于VWD的分型。（1）均正常，可排除VWD。（2）任一项减低，计算A/Ag，C/Ag比值，若均大 于0.7，则为VWD 1型（vWF量减少）。（3）若A/Ag0.7， VWD 2A,B，M三型（结构或功能缺陷）。以多聚体电泳鉴别。（4）若A/Ag0.7,C/Ag1.0。,【应用评价】 vWF:Ag是检测vWF最常用的指标，vWF:A主要指vWF的GPIb受体分子数量，二者比值对VWD分型有价值。,第二节 血小板检测,血小板的止血功能 主要： 粘附、聚集、释放 其次： 促凝、血块收缩,筛查试验：(
18、1)血小板计数（Platelet count）(2)血块收缩试验(CRT),血小板计数 【参考范围】 100-300109/L 400109/L为增加 【临床意义】血小板减低导致止血功能障碍，见血液一般检查,血液凝固-血凝块,血小板血栓收缩蛋白,纤维蛋白网 收缩,血清被挤出血块缩小加固,【原理】,2. 血块收缩试验（clot retraction test, CRT）,测定血清占血浆的比例,【方法】,全血标本注入试管中，加入Ca2+和凝血酶，静置，观察析出的血清占原有全血量的百分比。,表示血块退缩的程度,【参考范围】,2h 开始退缩 18h-24h 完全退缩 血块收缩率=血清(ml)/全血(m
19、l) (100%-Hct%)100% 参考范围：48%64%,【临床意义】,1主要用于血小板功能测定的初筛试验2收缩不良见于： a) 血小板功能异常或量（尤其正常对照值10s，延长 60%，小手术：35%。,基本常识内源凝血系统试验：CT.APTT外源凝血系统试验：PT共同途径试验：TTF：C减低：血友病A（分型)F：C减低：血友病BVit K依赖因子：、含量最高/分子量最大凝血因子：Fg半衰期最短因子：FVII半衰期最长因子：FXIII不稳定因子：FVIII和V,第四节 抗凝系统检测,病理性抗凝物质筛查试验,（1）APTT延长 因子缺乏或肝素、因子抗体、抗磷脂抗体，纠正试验鉴别：正常人血浆与
20、病人血浆等量混合，再测定APTT，仍延长则含因子抗体或抗凝物质。（2）凝血酶时间延长 Fg缺陷或者肝素。甲苯胺蓝纠正试验：血浆加入甲苯胺蓝，中和肝素，延长的TT恢复正常，则为肝素干扰。（3）临床中，患者血浆抗凝物质多为肝素或者抗磷脂抗体，在APTT和TT均延长而Fg正常时，多为肝素所致，若只有APTT延长，基本是抗磷脂抗体干扰，因此纠正试验无实用价值，很少做。,确诊试验,1. 病理性抗凝物质（1）肝素浓度测定（抗FXa活性）（2）狼疮抗凝物质（LAC）测定2. 生理性抗凝物质（1）抗凝血酶（AT）测定（2）蛋白C（PC）测定（3）蛋白S（PS）测定（4）组织因子途径抑制物（TFPI）测定（5）
21、凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）测定,【原理】以硅激活FXII，采用APTT测定原理，及硅化凝血时间（SCT），在筛查和确诊试剂中分别加入低浓度（干扰凝固）和高浓度（中和LAC）人工合成磷脂，若筛查试验SCT延长，而确诊试验SCT恢复，则存在LAC。计算方法：分别计算筛查SCT和确诊SCT与正常对照SCT比值，得到筛查比值（SR）和确诊比值（CR）,再计算SR/CR值即为标准化LAC比值（NLR），根据比值大小判断有无LAC。,狼疮抗凝物测定,【参考范围】 SR1.2, NLR1.2时，作确诊试验并计算NLR， NLR 1.21.5：LAC弱阳性； 1.52.0：LAC阳性 2.0：LAC强阳
22、性,抗凝血酶测定,【原理】血浆加入过量凝血酶，形成凝血酶-抗凝血酶复合物，剩余凝血酶作用于发色底物，使之释放出显色基团对硝基苯胺（pNA),颜色的深浅与剩余凝血酶含量与活性呈正相关，与AT呈负相关，根据吸光度可从标准曲线计算AT:A。【参考范围】80%-120%（发色底物法）,【临床意义】AT增高：急性出血性疾病，口服抗凝血药。AT减低：高凝状态可致血栓形成（1）遗传缺陷：含量或/和活性减低（2）获得性减低： 丢失增加：肾病综合征 合成减少：各种肝病 消耗增多：DIC、脓毒血症等（3）新生儿：肝脏未成熟（4）药物影响：肝素治疗初期，雌激素治疗3. AT减低可导致肝素治疗效果减低甚至无效。,第五
23、节 纤溶活性检测,筛查试验,（1）纤维蛋白（原）降解产物（FDP）测定（2）D-二聚体（D-D）测定（3）硫酸鱼精蛋白副凝固试验（3P试验）,纤维蛋白（原）降解产物测定,【原理】 免疫比浊法：血浆中加入乳胶包被的FDPs多克隆抗体，FDPs与相应抗体结合，使样本浊度增加，浊度强度与FDPs浓度呈正相关，根据浊度大小通过标准曲线可计算浓度。【参考范围】血浆5mg/L,【临床意义】 FDPs包括Fg和Fb的降解产物，其浓度反映体内总的纤溶活性。（1）增高：原发性和继发性纤溶所致 临床各科可导致高凝状态及血栓形成疾病：肿瘤、白血病、外伤、手术、感染、肝炎、休克、出血、流产、妊娠以及DIC、DVT、肺
24、梗死、心肌梗死和脑梗死等。（2）FDP为溶栓治疗是否有效的监测指标。,【原理】 免疫比浊法：血浆中加入乳胶包被的D-D单克隆抗体，其余同FDPs 【参考范围】血浆500ng/ml。,D-二聚体测定,【临床意义】 D-D是纤溶酶作用于交联纤维蛋白的特异分子标记物，是继发性纤溶的特异指标，有很高的敏感度。1. 继发性纤溶增高：临床各科可导致高凝状态及 血栓形成疾病：肿瘤、白血病、外伤、手术、 感染、肝炎、休克、出血、流产、妊娠以及 DIC、DVT、肺梗死、心肌梗死和脑梗死等。 2.原发性纤溶症：不升高,此是两者鉴别的重要指标。3.排除DVT和PE的指标：D-D不升高，可排除。4.观察溶栓疗效：溶栓
25、治疗后，D-D先于FDP恢复正常。,血浆鱼精蛋白副凝试验,【原 理】 纤溶过程中FDP （X片段） 鱼精蛋白 十 FM游离 纤维蛋白单体 FDP-FM复合物 FM聚集 （肉眼可见的丝状絮状胶冻状沉淀）【参考值】 正常人阴性,（plasma protamine paracoagulation test, 3P试验）,【临床意义】,阳性： 1提示血中大片段FDP和FM增多，见于DIC早、中期/纤溶亢进 2继发性纤溶与原发性鉴别 3大出血（创伤、手术、咯 血、呕血），恶性肿瘤、人工流产等阴性： 1正常人 2原发性纤溶 3DIC晚期,确诊试验,（1）组织性纤溶酶原激活剂（t-PA）测定（2）纤溶酶原（
26、PLG）测定（3）纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）测定（4）纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）测定 费用高，临床应用较少。,作为一个临床医生,血栓与止血具有明显的复杂性，如何正确选择相关的实验室检查项目如何正确判断检验结果,检测项目的选择和应用,血栓与止血的检测主要用于血小板量与质异常、凝血障碍、血栓前状态和血栓性疾病的临床诊断、鉴别诊断、病情观察、疗效评价和预后判断，用于抗凝、溶栓、抗血小板治疗的监测。血栓与止血检查方法繁多，可先选择简单易行的筛选试验，再逐步做确诊试验。,筛查试验的选择与应用,（一）一期止血缺陷检测的选择,一期止血缺陷指血管壁和血小板异常所致的出血性疾病。 1筛选试验
27、血小板计数(Plt)和出血时间(BT) 2诊断试验 血小板减少原因: 骨髓穿刺涂片、骨髓活检、血小板寿命测定、血小板相关免疫球蛋白测定等。 血小板功能异常: 血小板粘附试验、血小板聚集试验、血块收缩时间等。,筛选实验,（1）Plt和BT都正常：多见于血管壁异常所致的出血性疾病，如过敏性紫癜、单纯性紫癜、遗传性出血性毛细胞血管扩张症和其他血管性紫癜。 （2）Plt减少，BT延长：多数为血小板减少性紫癜 （3）Plt增多，BT延长：多数为血小板增多症 （4）Plt正常，BT延长： 见于：血小板功能异常：血小板无力症等 某些凝血因子严重缺乏：低（无）纤维蛋白原症、血管性血友病。,（二）二期止血缺陷检
28、测的选择,二期止血缺陷指凝血因子缺乏和抗凝物质所致的出血性疾病 1筛选试验 APTT和PT （1）APTT和PT都正常：除正常人外，仅见于先天性和获得性因子缺乏症。 （2）APTT延长，PT正常：多数见于内源性凝血途径异常（FVIII,IX,XI,XII）,自身免疫疾病。常见于血友病甲，乙。 （3）APTT正常，PT延长：多数见于外源性凝血途径缺陷。 （4）APTT和PT都有延长：共同凝血途径缺陷（FI, II，V, X），以及肝脏疾病、应用肝素等。 2诊断试验 凝血因子缺乏可选用纠正试验、凝血因子活性测定。,（三）纤溶亢进筛查试验的选择,指纤维蛋白（原）和凝血因子被纤溶酶降解所引起的出血。1
29、.筛选实验：FDP 和D-D1）FDP和D-D均正常：表示纤溶活性正常，出血与纤溶无关2）FDP阳性，D-D阴性：多为原发性纤溶症或FDP假阳性如肝病、术后大出血、重症DIC、纤溶初期等（不可能DD阴性）：单纯原发纤溶不存在。3）FDP阴性， D-D阳性：多数为继发性纤溶症或FDP假阴性如DIC、血栓形成和溶栓治疗等（不存在）。4）FDP和D-D均阳性：见于继发性纤溶，如、血栓性疾病、DIC和溶栓治疗。临床最常见。,2诊断试验,优球蛋白溶解时间血浆纤溶酶原活性血浆纤溶酶原激活抑制物-1活性血浆2-纤溶酶抑制物活性血浆凝血酶时间血浆纤溶酶-抗纤溶酶复合物测定,出血性疾病项目的选择,血小板质和量异
30、常项目选择,获得性凝血障碍项目选择,血栓性疾病的项目选择,血栓前状态,【概念】血液有形或无形成分的生物化学和血液流变性发生病理改变，有可能发生血栓或血栓性疾病的状态。,筛查试验,（1）PT和APTT缩短（2）Fg浓度增高（3）PAR增高（4）血液黏度增高优点：简单、方便、快速、经济缺点： 敏感性相对较低。,常用试验,主要检测各系统特定成分和分子标志物。（1）vWF:Ag/ET-1/TM增高：内皮损伤（2）P-选择素/ -TG增高：PLT活化（3）TF增多：组织损伤释放TF，启动外源途径（3）sFM/F1+2/FPA增高：凝血酶增多（4）TAT增高/AT：A减低：结合凝血酶致消耗增加（5）FDP和D-D/PLG正常：纤溶活性减低,易栓症诊断的项目选择,动/静脉血栓诊断项目选择,动脉血栓: ACS、脑梗死、PE 诊断项目选择原则：血小板和血管内皮细胞损伤标志物（vWF、ET、P-selectin、PAR等），凝血与纤溶有一定改变，APTT和PT多无变化。2. 静脉血栓：DVT、PE、浅静脉血栓 诊断项目选择原则：凝血因子和纤溶活性（凝血活化标志、AT、D-D等）。,
