1、代谢控制发酵,Chapter 3 微生物的代谢调节机制,第一节 微生物细胞中代谢调节的部位与举措,一、原核微生物细胞的代谢调节部位,（一）与细胞质膜密切相关的调节,1. 膜的脂质（磷脂及其它脂类）的分子结构，以及环境条件（如离子强度、温度、pH等）对膜脂质理化性质的影响。2. 膜蛋白（如酶、载体蛋白、电子传递链的成员及其它蛋白质）的绝对数量及其活性的调节。3. 跨膜的电化学梯度以及ATP、ADP、AMP体系及无机（P）浓度对溶质输送的调节。4. 细胞壁结构（特别是骨架结构）的部分破坏或变形，间接影响到膜对溶质的通透性。,（二）细胞空间内存在的酶分子的数量及它们活性的调节,1. 微生物可改变生物
2、合成代谢途径中的酶量，特别是关键酶合成或降解的相对速率，进而调节代谢流向。 2. 可改变酶的活性，特别是关键酶的活性（力）来调节代谢速度。 3. 酶和底物的相对位置 限制酶与基质的有形接触（代谢途径的区域化）,二、真核微生物细胞的代谢调节部位,三、原核生物和真核生物在 基因表达上的重要区别,四、生物进化与代谢调节机制的出现,（1）酶水平的调节（2）细胞水平的调节（3）激素水平的调节（4）神经水平的调节,五、微生物细胞的代谢调节的主要举措,1.酶合成的调节 2.酶活性的调节 3.能荷的调节 4.细胞膜透性的调节,第二节 酶合成的调节机制,酶合成调节机制主要有：,1.酶的诱导负向控制（如乳糖对-半
3、乳糖苷酶）与正向控制。2.终产物阻遏作用和弱化调节。3.分解代谢物阻遏（如葡萄糖对-半乳糖苷酶的阻遏）。4.转录后的调节。,一、诱导作用（酶合成的诱导作用）,是指培养基中某种基质与微生物接触而增加（诱导）细胞中相应酶的合成速率。诱导的生理作用是可以保证能量与氨基酸不浪费，不把它们用于合成那些暂时无用的酶上，只有在需要时细胞才迅速合成它们。,（一）诱导机制（操纵子转录）,1. 操纵子（元）Operen 所谓操纵子（元）是指结构上、功能上、协同作用的相关基因组成的一个片段（区域）。操纵子假说认为：编码一系列功能相关的酶的基因在染色体中紧密排列在一起，且它们的表达与关闭是通过同一控制点协同进行的。,
4、每个操纵子（元）至少由4个基因（部分）组成。（1）调节基因（R.I.C）（Regulatory gene) （2）操纵基因（Operator gene） （3）结构基因（Structural gene） （4）启动基因（Promoter gene）,（1）调节基因（R.I.C ）（Regulatory gene),它能编码、调节（阻遏）蛋白，现发现有两种调节蛋白： 1.阴性（负作用）调节蛋白（Negatire-acting protein），此种调节蛋白也称为阻遏物（Repressor）。 2.正作用调节蛋白（Positire-acting-protein）,此种调节蛋白也称为激活因子（Act
5、iration）。,（2）操纵基因（Operator gene）,是操纵子中一个成员，它能控制决定蛋白质（酶）的氨基酸顺序的一整套结构基因的转录，而操纵基因可受调节基因产生的阻遏物所阻遏，许多情况下，单个操纵基因可以控制一个或一个以上（多个）结构基因。,（3）结构基因（Structural gene）,是指在操纵基因邻近（一般在下游处）存在一个或多个基因，它编码不起调控转录作用的蛋白质，如酶、膜蛋白和核糖体等。一部分结构基因的RNA合成速度精确地被控制，但许多结构基因以一种（或多或少）不变的速度持续地转录DNA上的遗传信息，生成相应的信使RNA（mRNA）进而转译成特定的酶（蛋白质）。,（4）
6、启动基因（Promoter gene）,启动子（基因）含有两个和RNA多聚酶结合的顺序，一个集中在RNA多聚酶起始位置前约10个碱基对，另一个则集中在这个位置前35个碱基对，当RNA多聚酶与启动子接触并结合上去，mRNA合成即开始。 如阻遏物（阻遏调节蛋白）与Operator gene 结合，则RNA聚合酶就不能和Operator gene 结合，就不能向前移动，也就不能转录出互补于结构基因（S）的DNA顺序的mRNA。也就没有酶的生成。而在E.coli中启动基因必须经过（环化AMP受体蛋白复合物）的激活后，才能启动。 这些基因形成整套调节控制机制，才能使生命系统在功能上有序、有效及开放。,2
7、、 DNA与蛋白（阻遏蛋白）的结合,蛋白质与核酸的相互作用一般可分为非专一性，蛋白质可以结合到核酸的任何部位；专一性，蛋白质结合到特定的核酸的部位。,(二) 酶合成的诱导（转录的负控诱导和正控诱导）实例及机制,实 例（1）酶合成的负诱导机制（大肠杆菌乳糖操纵子）,（2）转录的正控诱导 麦芽糖操纵子,机 制 转录的正负诱导调控 当大肠杆菌细胞以阿拉伯糖作为生长所需碳源和能源时，它们产生三种将阿拉伯糖转化为木酮糖的酶。,图2-12 阿拉伯糖对ara操纵子araC位点的调控作用,（三）诱导物的种类,诱导分解代谢酶类属于诱导酶的范畴。例如，淀粉酶是由淀粉诱导合成的，蔗糖酶与脲酶分别由蔗糖和尿素诱导。细
8、胞在代谢过程中生成的产物也可以作为诱导物。荧光假单孢菌在色氨酸大量存在时。色氨酸的代谢产物犬尿酸便可诱导分解色氨酸的酶系。,（四）诱导调节的克服,只有需要时才合成所需的酶是微生物应有的、正常的调节机制。如不设法绕过这种机制，就难于使所需要的诱导酶大量生产。据此，我们可采用诱变方法，借强力因素诱变，引起突变，消除诱导酶，合成所必需依赖诱导物这种障碍，如突变不是发生在结构基因上，而是发生在调节基因或操纵基因上，从而导致调节基因编码的阻遏物（阻遏蛋白）无活性，或操纵基因对活性阻遏物的亲和力衰退，则无需诱导物便能产生诱导酶，这种突变作用称为调节性或组成型突变。具有这种特性的菌株称为组成型突变株。,组成
9、型突变株的获得、富集方法。,1.在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选。 2.将菌株轮番在有、无诱导物的培养基中培养。 3.使用诱导性能很差的基质。 4.使用阻碍诱导作用的抑制剂。 5.提高筛选效率的方法，即组成型突变株的富集。,二、酶合成的阻遏和弱化（终产物的阻遏、弱化）实例及机制,(一) 实 例 (1) 转录的负控阻遏,L-色氨酸操纵子的结构,图2-14 大肠杆菌trp操纵子,trp operon阻遏系统终产物的阻遏机制,(2)转录的衰减（弱化作用）,弱化子 随着对trp operon 的深入研究，发现有些现象与以阻遏作为唯一调节机制的观点不相一致。例如，在高浓度和低浓度下观察到，trp op
10、eron的表达水平相差约600倍，然而阻遏作用只可使转录减少70倍。，显然trp operon表达的这种控制与上述阻遏物的控制无关，必须有一种称为弱化作用的调控机制。这个前导区域称为弱化区域，这个前导肽称为弱化子。,（二）机制(1)转录弱化作用的调控,A.当trp缺乏时（低水平的trp 时） B. Trp浓度很高时,（2）阻遏作用和弱化作用的区别与协调,A. 区别 可阻遏操纵子的表达：在无阻遏物存在时，取决于RNA聚合酶与启动子的相互作用或启动频率，若终产物（氨基酸）过量时，它作为辅阻遏物（corepressor）干扰转录的发动。 Trp、His等操纵子中存在弱化子，操纵子的表达与转录起始频率
11、以及启动子的调节关系不大，而主要取决于弱化子的控制。RNA多聚酶要么在弱化子处停止最终脱落下来，要么向结构基因方向通过去。也就是当过量的终产物（氨基酸）存在时，使细胞内有过量的对应氨基酸的氨基酰tRNA产生，它能使已发动的转录终止在第一结构基因前。,B.协调 一般认为野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物。若获得无活性阻遏物的突变细胞，Trp合成酶的浓度就比野生型细胞高出10倍以上。因此培养基中色氨酸浓度的变化就会影响这两种阻遏物的平衡，使之发生倾斜，最终发出关闭或启动Trp操纵子的命令，从而维持细胞内色氨酸的含量。,那么细菌中为什么还需要弱化子调控系统呢？其原因可能是： a.阻遏物从有
12、活性到无活性的转变速度极低，需要有一个能更快地做出反应的系统来维持适当氨基酸的水平。 b.弱化子系统主要是对外源氨基酸（色氨酸）浓度作出反应。,为什么还要阻遏体系呢？ 没有阻遏体系，似乎只有弱化作用也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为当有大量外源色氨酸存在时，通过阻遏体系阻止非必须的先导mRNA合成，使合成更加经济。 当然His操纵子中，没有阻遏体系，只有弱化子调节。所以说明弱化子的调节作用是控制转录的终止，控制转录精细，是阻遏调控体系的次级调节。,三、分解代谢物阻遏（catabolitic repression）调控,（一）分解代谢物阻遏的概念 所谓分解代谢物阻遏是指当细胞内具有一优先利用的
13、营养物（通常是，但并不总是葡萄糖）时，其分解产物对分解利用其它（难利用）营养物质所需的酶系合成起阻遏作用。,（二）分解代谢物阻遏的实质,分解代谢物阻遏的实质是由于细胞内缺少了cAMP。,(三) cAMP是对酶合成水平的控制,（1）Lac.opern中的启动基因P包含两个位点：A，与CRP基因编码的一种调节蛋白，称cAMP受体蛋白简称CRP或CAP结合点。B，和RNA多聚酶结合的位点。,(2)转录开始时，cAMP先与CAP或结合生成cAMP-CAP复合物。 (3) CAP-cAMP复合物再与Lac.opern中的启动基因P的CAP结合位点结合，从而激活了位点，进而促进RNA多聚酶与它的结合位点结
14、合，使转录启动（注意CRP起正的作用），所以解除了分解代谢物的阻遏。,（4） RNA多聚酶进入RNA多聚酶位点向前漂移（5）当有诱导物存在时，RNA多聚酶进入操纵基因O位点内的转录起始点（6） cAMP在乳糖操纵子转录中是通过CAP-cAMP复合物与DNA结合时促进转录的，这种调控是正调控。 （7）细胞内cAMP水平在某些方向反映出细胞内能量的状态。 ATP cAMP AMP cAMP水平与腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶的相对活性有关。,若CRP基因失活的突变株，就不能诱导任何分解代谢物阻遏系统酶的合成，因而只能在易被利用的基质上生长。若腺苷酸环化酶丧失的突变株，那么cAMP水平下降，那么就不能在受
15、阻遏的碳源（如甘油、乳糖、蔗糖）等上生长，但它和CRP缺陷突变株不同，外源加入cAMP还是有效的。,(四) 葡萄糖对细胞内cAMP水平的调节,（1）可能是由于葡萄糖分解过程中的某些中间产物抑制了细胞内cAMP的形成。（2）可能是这种中间产物激活了cAMP的分解,（五）分解代谢阻遏的分子机制,（六）分解代谢物阻遏作用的克服,1、生产培养基内不使用阻遏性碳源，将有利于对分解代谢物阻遏敏感酶的生产。 2、可利用一种不能代谢的诱导物的类似物，或缓慢补入诱导物或使用只能缓慢代谢的诱导物的衍生物来增加酶的生产。3、选育耐（抗）分解代谢阻遏的突变株,（七）转录中的几个操纵子的复合调控作用 营养状态对操纵子活
16、性的影响,（1）lar. operon中A.no glucose, cAMP high, no lactose; B.glocose present, cAMP low, no lactose C. B.glocose present, cAMP low, lactose present; D. no glucose, cAMP high, lactose present。,（2）阿拉伯糖操纵子中,A.当有葡萄糖而无阿拉伯糖时，因为葡萄糖的存在cAMP 所以无cAMP-CAP，又无阿拉伯糖。则细胞内AraC蛋白以Cr型而结合到A位点上，因此Pc基本上不同RNA多聚酶结合，只产生少量的AraC蛋
17、白。在有葡萄糖存在时Ara糖操纵系统没有必要处于活化状态。事实上也是处于静态状态的，虽然不是完全被关闭，但也是最大限度地受到抑制。,B.因为无诱导物ara，尽管cAMP-CAP、CRP与操纵区位点结合AraC蛋白仍以Cr(Cpr)形式为主，无法与操纵区B位点结合，无AraBAD的mRNA转录。当无葡萄糖又无阿拉伯糖时，若cAMP量增加，cAMP-CAP位点被占据，Cr仍使Arac蛋白保持在最低浓度的水平。不过Cr与RNA多聚酶的竞争（不象Ci那样有效）所以可产生一些Arac蛋白。除非还有其它某种碳源，否则既缺乏葡萄糖又缺乏阿拉伯糖的细胞是不可能生长的。,C.当无葡萄糖,有阿拉伯糖时，大量的Ar
18、a基因产物是以Ci（Pi）形式存在，并分别与操纵区B、A位点相结合，无葡萄糖cAMP-CAP位点也被占据。在cAMP-CAP的共同作用下使AraC和AraBAD基因大量表达，操纵子充分激活。,四、转录后的调节,前边讲的酶合成的诱导，终产物的阻遏或弱化，分解代谢物的阻遏都是在转录水平上的。,（一）遗传控制,1、细菌基因的转录和转译的可能调节位点,2、真核生物基因表达调控,转录后水平的调控（1）转录产物的加工和转运调节，通过不同方式的拼接可产生不同的mRNA，从而产生多种多样的蛋白质。（2）翻译水平的调节主要是控制mRNA的稳定性和mRNA翻译的起始频率。（3）翻译后水平的调节主要控制多肽链的加工
19、和折叠，产生不同功能活性的蛋白质。,（二） 信号传导和二组分调节系统,二组分系统由二种不同蛋白质组成：1.位于细胞质膜上的传感蛋白（sensor protein）该蛋白质具有激酶活性，又称传感激酶。2.应答调节蛋白（response regulator protein）位于细胞质中。传感激酶在与膜外环境的信号反应过程中本身磷酸化，磷酰基因被转移到应答调节蛋白上。磷酸化的应答调节蛋白即成为阻遏蛋白，该阻遏蛋白再通过操纵子的阻遏作用进行调节控制结构基因的转录。,（三） 细菌的应急反应/紧缩响应（stringent response）,1. 紧缩响应（应急反应） 2. ppGpp 的生理功能 3.
20、PPGPP对核糖体蛋白质合成的影响,1. 紧缩响应（应急反应） 当细菌处于一种或数种氨基酸全面匮乏的“氨基酸饥饿”状态时，总之是在营养不良条件下生长时，为了响应这种困难环境，细菌必须迅速地关闭许多生理活动，停止包括各种RNA（特别是rRNA）在内的几乎全部生物化学反应过程，只保持维持生命最低限量的需要。RNA合成速度下降1020倍，使RNA合成水平降到正常状态的510%，mRNA总合成量减少3倍，蛋白质降解速度提高，碳水化合物、脂类合成均明显减少等。这一系列响应称为stringent response或stringent control,2. ppGpp 的生理功能,关于ppGpp 和pppG
21、pp的作用原理尚不清楚,目前认为a) 它们是细菌细胞紧缩控制（反应）的信号或称警报素（alarmone）,当细胞处于氨基酸缺乏时，它们的水平升高。b) ppGpp与RNA聚合酶结合，使后者构型发生改变，从而识别不同的启动子，改变基因转录的效率或关闭、或减弱、或增加。在大肠杆菌中，ppGpp抑制6sRNA聚合酶活性，于是rRNA操纵子不能表达抑制rRNA的合成。c) ppGpp与启动子结合，使后者不再与RNA聚合酶结合，导致基因被关闭。d) ppGpp 和pppGpp不只影响一个或几个操纵子而是影响一大批，也不只调控转录，而也具有调控翻译，所以它们是超级调控因子。,3、 PPGPP对核糖体蛋白质
22、合成的影响,前边已介绍了PPGPP对转录的调控，即在氨基酸短缺的情况下，首先被停止合成的是rRNA，而核糖体是由rRNA和核糖体蛋白质构成的。是翻译遗传密码的唯一场所，rRNA的量骤然下降，核糖体蛋白质失去了结合对象而成为多余的了。由于某些核糖体蛋白的mRNA的部分二级结构和rRNA的部分二级结构相似。当rRNA短缺时，多余的核糖体蛋白与本身的mRNA结合，从而阻断本身的翻译，同时也阻断同一多顺反子的mRNA下游其它核糖体蛋白质的合成和rRNA的合成几乎同时停止。这里rRNA合成是转录水平的调控，而核糖体蛋白质的合成则是翻译水平的调控。,第三节 酶活性的调节机制（蛋白质水平上的调节）,一、酶活
23、性的调节,酶活性的调节是指一定数量的酶,通过其分子结构的改变来调节其催化反应的速率。,酶活性调节的影响因素,（1）底物和产物的性质和浓度（2）环境因子（如浓度、压力、pH、离子强度和辅助因子等）以及其它酶的存在都有可能激活或抑制酶的活性。,（一）激活,在激活剂的作用下，使原来无活性酶转变的有活性或使原来活性低的酶提高。这种现象称为激活或活化。凡能提高酶活性的物质称为激活剂。 属于代谢调节的激活作用主要是指代谢物对酶的激活，这类激活作用主要有两种。,（二）抑制,抑制与激活相反，由于某些物质的存在，降低酶活性，称为抑制。抑制可以是不可逆的，这将造成代谢作用的停止；也可以是可逆的，即当抑制剂除去后酶
24、活性又恢复，在代谢调节过程中所发生的抑制现象主要是可逆的，而且大多属于反馈抑制。,二、酶活性调节机制,酶活性调节机制有多种理论解释，主要有:（1）别构（变构）调节理论（其核心是酶分子构象的改变）（2）酶分子的化学修饰理论（其核心是酶分子结构的改变）（3）其它调节机制,（一）别构（变构）酶调节,别构（变构）效应是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。变构蛋白质是表现变构效应的蛋白（例如阻遏蛋白），具有变构作用的酶称为变构酶。,1、别构（变构）酶的结构和特性：,（1）别构酶含多个亚基的四级结构的蛋白质（一般为四聚
25、体），亚基的结构和功能可以相同，也可以不同。（2）别构酶分子中含有两个中心，即催化中心和调节中心，它们在空间上是分开的，可以在不同的亚基上，也可以在同一亚基的不同部位上。（3）每个别构酶的分子可以结合一个或多个配体（底物或效应物）理论上结合底物的最大数目与催化中心的数目相等。结合效应物的最大数目应与调节中心的数目相等。（4）配体和酶蛋白的不同部位（或亚基）结合时，可在底物底物，效应物底物和效应物效应物之间发生协同反应，此效应可以是促进（正协同）或阻抑的（负协同）。,2、变构酶活性调节类型（模型）,（1）莫诺德等人的模型（协同模型） (2) 科仕兰等人的模型或称顺序模型,3、变构酶的反应动力学性
26、质,变构酶的反应动力学不同于普通酶的，它不符合米氏动力学方程式。 普通酶反应速度和底物浓度的关系为：V=（VmaxS）/（Km+S） 变构酶反应速度和底物浓度的关系为：V=（VmaxS）n/（Km+Sn） V：酶促反应速度，Vmax：最大反应速度，S：底物浓度，Km：米氏常数，n：亚基数,变构酶的反应速度与底物浓度（或变构抑制剂的浓度）的关系曲线呈S型，有协同性；当底物或效应物浓度极低时，酶反应速度的变化极微小，这是因为效应物浓度极低时，不具有协同性，当效应物浓度超过某个水平（阈值）时酶反应速度急剧增大（减小）。即存在着底物或效应物对反应速度发生影响的阈值。这在代谢控制上具有很大的生理意义。,
27、4、变构酶调节的实例,E.coli的天冬氨酸转氨基甲酰酶，简称ATCase，它是以构象转变进行反馈抑制的典型例子。它是催化嘧啶核苷酸合成途径中的第一个反应的酶。ATCaae催化ASP与氨基甲酰-P之间的转移而合成氨基甲酰天冬氨酸。此酶受末端产物CTP的反馈抑制为ATP激活。,5.变构酶调节的特征：,Monod，changcux与Jacob认为变构酶调节有以下特征：（1）参加与酶活性调节的变构因子是一类能与变构蛋白分子互补结合的小分子化合物，又称为效应物或调节性分子（通常这些效应物在结构上同基质或产物完全不同）。大多数情况下效应物引起的抑制作用是混合型不同于竞争性、非竞争性或无竞争性的抑制作用。
28、这种现象恰好与认为效应物不与酶活性中心结合的主张相符。（2）许多变构酶的反应动力学性质与一般酶不同，以酶反应初速率与基质浓度作曲线，得到的不是典型的双曲线，而是带点S形曲线（S形表示在低基质浓度下，随基质浓度的提高，酶反应速率的提高加快）这种现象称为正协调作用。,（3）效应物同调节性酶的结合与基质同酶的结合位点是分开的，但又相互联系的，用多种物理或化学方法处理能使酶脱敏（即对应效应不再敏感），但保留其催化活性。（4）酶的活性中心及（变构）中心（调节性位点）可同时被结合，变构中心（副位点）的结合不一定是特异性的（专一性），可以结合不同的物质，产生不同的效应，变构中心的结合可能引起蛋白质分子构象的
29、变化，从而影响酶活性中心的催化活性。 （5）变构效应是反馈抑制的基础，是调节代谢的有效方法。,6、变构酶的脱敏作用（desensitingation）,变构酶经特殊处理后，不丧失酶活性而失去了对变构效应物的敏感性，称为脱敏作用。 可通过许多方法：加热处理、050C低温处理、化学试剂（汞盐、对氯汞苯甲酸（PCMB）、尿素等）透析、X射线照射、蛋白酶有限水解、pH的改变等等。,（1）使变构酶解聚： 可利用上述物理、化学等方法处理变构酶，可使变构酶多聚物解聚导致对效应物脱敏，失去调节功能。解聚后的单体不再相互作用，失去协同性的反应速度与底物浓度之间的关系曲线不再呈S形，而是一般酶那样的双曲线。（2）
30、基因突变 为变构酶编码的结构基因的突变可引起脱敏，如诱变育种获得抗类似突变株中多发生这种变化，在氨基酸的核苷酸发酵育种上，已作为突破微生物代谢控制的一个重要手段利用。,（二）酶的共价修饰共价调节酶,共价修饰是酶蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解离，使其活性改变（导致调节酶活化或抑制）以控制代谢的速度和方向，这是一种快速、灵敏、高效的细调方式。从酶蛋白质中除去或加入小化学基因可以是磷酸基、甲基、乙基、腺苷酰基。而蛋白质共价结合部位,一般为丝氨酸残基的-CH2OH，由共价修饰引起酶活性（有时还涉及调节特性）改变的酶叫共价调节酶。共价修饰作用可分为可逆的和不可逆的。,这些酶它
31、们由于小化学基团（磷酸基、甲基、乙基、腺苷酰基等）对其酶蛋白质结构进行共价修饰，使其结构在活性(高活性)和非活性(低活性)转变。已知有多种类型的可逆共价修饰蛋白（酶），它们是： 1.磷酸化/去磷酸化 2.乙酰化/去乙酰化 3.腺苷酰化/去腺苷酰化 4.尿苷酰化/去尿苷酰化 5.甲基化/去甲基化 6.S-S/SH 相互转换等等,例2 E.coli中谷氨酰胺合成酶就是这样一种共价调节物,2、不可逆共价修饰,3、共价调节酶调节的特点,（1）作用方式：酶都具有两种形式即无活性（低活性）和有活性（高活性）。 （2）作用本质：与别构调节不同，是酶分子共价键发生了改变，即酶的一级结构发生改变，而别构酶中酶分
32、子只发生非共价键的改变，即构象的改变。 （3）作用能耗：所需酶分子比生物合成酶要少，在酶分子发生磷酸化等修饰作用反应中，一般每个亚基只消耗一个分子ATP，比一亚基生物合成所需的ATP少很多。 （4）作用效率：共价调节酶的调节信号具有放大效应，其催化效率比别构酶调节要高很多。,第四节 能荷的调节,一、能荷的概念（energy charge） 能荷是一个表示细胞能量状态的参数。是细胞中所含腺苷酸中含有相当于ATP的数量百分比，其表示式为：能荷（EC）=（ATP+0.5ADP）/（ATP+ADP+AMP）100%当细胞中腺苷酸全部是ATP，能荷为1；当细胞中腺苷酸全部是ADP，能荷为0.5；当细胞中
33、腺苷酸全部是AMP，能荷为0 当细胞或线粒体中三种核苷酸同时并存时，能荷大小随三者比例而异，三者的比例随细胞生理状态而变化。,E.coli生长期间，能荷为0.8，静止期为0.5，低于0.5时死亡； Asp.niger柠檬酸生产菌，生长期能荷为0.85，而产酸期为0.8。 另外一个度量细胞能量状态的参数是磷酸化位。磷酸化位=ATP/ADPPi 磷酸化位除了腺苷酸外，还决定于无机磷浓度。 磷酸化位与能荷相比，其值变化范围更宽，因此是反映细胞能量状态更加灵敏的指标。,在某种意义上，可把ATP当作糖代谢的末端产物。当ATP过量时会对合成ATP系统产生反馈抑制。当ATP分解为ADP、AMP 、Pi时。将
34、其能量供给合成反应时，ATP生物合成的反馈调节被解除，ATP又得以合成。因此，能量不仅调节生成ATP的分解代谢酶类的活性，也能调节利用ATP的生物合成酶类的活性。糖代谢和中心代谢途径中的酶活性受能荷的调节。,当能荷降低时：则激活催化糖分解，（能量生成）酶系，或解除ATP对这些酶的抑制（如糖原磷酸化酶、果糖磷酸激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、反丁烯二酸酶等）并抑制糖原合成酶，1、6磷酸果糖酯酶，从而加速糖分解和TCA的产能代谢。 当能荷生高时：细胞中AMP，ADP转变为ATP，这时ATP则抑制糖原降解以及糖酵解和TCA环中的关键酶（如糖原磷酸化酶，磷酸果糖激酶，柠檬酸合成酶，异柠檬酸脱氢酶）
35、并激活糖类合成酶（糖原合成酶、1、6-P-果糖酯酶）从而抑制糖的分解，加速糖原的合成。,二、能荷调控的实例,（一）巴斯德效应（Pasteur effect).什么是巴斯德效应？ 是能荷调节的一个好的实例。巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现：在通氧的情况下，由于进行呼吸作用，酒精产量大大下降，糖的消耗速度也变缓，这种有氧呼吸抑制发酵的作用被后人称为巴斯德效应。,.巴斯德效应的本质,（二）补偿控制系统的调节,草酰乙酸的合成受几种产物的反馈调节，若CDP、CTP浓度升高，ATC酶受抑制导致Asp积累，Asp过量而抑制PC酶，草酰乙酸浓度下降。 然而对TCA环的运转必须有草酰乙酸，为了不使草酰乙酸缺乏，
36、这就需要补偿激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，此酶的激活主要有CTP，1,6-P果糖，和乙酰CoA达代谢平衡，因为ATC酶不仅受CTP反馈抑制，还受嘌呤核苷酸ATP的激活 通过ATP的激活，减少Asp的积累，从而解除Asp对PC的抑制，获得草酰乙酸,（三）抗生素发酵中，能荷对次生代谢的调节,在四环素的生物合成中，以丙二酸单酰CoA为前体，在菌体内丙二酸单酰CoA的合成有两条途径：一条是，磷酸烯醇式丙酮酸生成乙酰CoA，再在乙酰CoA羧化酶催化下生成丙二酸单酰CoA；另一条是在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化下，由PEP 草酰乙酸丙二酸单酰CoA。 研究发现：在菌体生长旺盛时期，乙酰CoA羧化酶活性高，PE
37、P羧化酶及草酰乙酸脱羧酶活性低，而在四环素合成期，乙酰CoA羧化酶活性低，PEP羧化酶、草酰乙酸脱羧酶活性高，这说明是由PEP羧化酶催化PEP生成草酰乙酸，再经草酰乙酸生成丙二酸单酰CoA进而生成四环素。,TCA环运转状况调节了四环素的合成。当TCA环酶活性高时，葡萄糖完全氧化产生大量ATP，过量的ATP对PEP羧化酶有反馈抑制作用。使草酰乙酸生成量 同时过量的ATP对柠檬酸合成酶有反馈抑制作用。柠檬酸、异柠檬酸合成减少 而柠檬酸、异柠檬酸对草酰乙酸脱羧酶有激活作用。 由于上述两方面的作用，控制着四环素的合成。,还发现在四环素的合成阶段，低产菌株的TCA环酶系活性比高产菌株高25倍，因此在生产
38、中采用。（1）选育呼吸弱（缺乏）的突变株，降低菌株呼吸链的强度。（2）在培养基中加入硫氰酸苄脂（浓度为510-5 mol/L）等。 由于氰化物与含铁噗啉的酶中的Fe2+ 结合，使酶失活、抑制、呼吸链电子传递过程，使ATP减少，解除ATP的反馈抑制作用。 另外金霉素链霉菌生长后期体内的聚合磷脂含量提高，而ATP减少，并维持低水平。避免ATP过量产生的抑制作用，而菌体进行葡萄糖磷酸化时，由聚合磷酸脂提供Pi。,三、不产生ATP 的呼吸侧链的发现,微生物利用葡萄糖在好氧条件下，生长或发酵过程，实际上包括以下三个过程。（1）底物的脱氢作用（2）氢或电子传递（3）受氢体接受氢,最近研究发现在Asp.ni
39、ger柠檬酸产生菌和谷氨酸棒杆菌中。在柠檬酸发酵过程中，除了有上述的正常呼吸链外，发现不产生ATP的侧呼吸链。此侧链对氰化物，制霉素敏感， Asp.niger柠檬酸产生菌中它对水杨苷氧肟酸敏感。Asp.niger柠檬酸产生菌和谷氨酸棒杆菌为什么在好氧下进入TCA环后，能大量积累柠檬酸和谷氨酸，若代谢中脱下来的氢完全通过正常的呼吸链交给O2，ATP大量产生，糖代谢和生成柠檬酸和谷氨酸的酶系受抑制，就无法大量生成发酵产物。看来在产物形成时，有部分氢是通过旁路交给O2的，不产生ATP。,如果我们通过诱变等选育具有较强呼吸旁路系统的菌株，那么菌种代谢生成的NADH可较多地通过此测链将氢交给O2，既满足
40、菌种生存，又减少ATP生成，这样就减轻ATP对糖代谢关键酶和柠檬酸、谷氨酸生成酶系的反馈抑制作用，更有利于高产柠檬酸、谷氨酸。,第五节 代谢产物分泌的调节,一、代谢产物分泌的机制 代谢产物的分泌，也是物质运送过程，一般认为是利用物质进入细胞的逆过程来完成的，但也有不少例外。必须指出，由于微生物具有高度严密的自我调节能力，中间代谢产物不会大量积累而排除体外。发酵工程的任务之一是人为地改变微生物代谢调控机制，其中包括改变代谢物的膜透性，使目的产物及时地分泌出体外，避免在体内积累而引起反馈抑制。,（一）氨基酸的分泌,对于微生物细胞的氨基酸的分泌机制尚不够清楚，一般认为，无论哪种微生物细胞内氨基酸库中
41、最多的谷氨酸（G-细菌细胞未发现有游离的氨基酸），因此正常培养下，微生物有少量氨基酸（尤其是Glu，Asp）的分泌， 在霉菌和细菌培养液中发现有1mg/mL左右。 微生物在增殖旺盛期，由于蛋白质大量合成，细胞内库存氨基酸减少，这时游离的谷氨酸大约只有最大量的二分之一，只有当细胞内生物合成的氨基酸不被用于合成蛋白质或其它代谢系统时，使库存量提高，才容易作为排出物向细胞外分泌。,与氨基酸吸收的情况一样，氨基酸分泌机制因菌种及氨基酸种类而异。其中谷氨酸产生菌的谷氨酸分泌进行了大量研究，其机制概括如下： 1. 当谷氨酸产生菌增殖时，细胞壁膜扩增和形成间体时，细胞伸长2倍长度时，再加上缺乏生物素等条件影
42、响，停止谷氨酸产生菌分裂，谷氨酸用于合成蛋白质或其它代谢系统停止，细胞内谷氨酸库大量增加，再加上谷氨酸产生菌不发生自溶，细胞仍有活力，将葡萄糖通过其生物合成途径，源源不断地生物合成谷氨酸，为从细胞内细胞外分泌谷氨酸提供必要的充分条件。 2. 通过控制生物素、油酸、甘油的亚适量或表面活性剂等，使谷氨酸产生菌的细胞合成不完全，使其磷脂含量降低为正常细胞的二分之一左右，或通过添加青霉素等破坏细胞壁合成，从而导致细胞膜的渗漏，使谷氨酸大量向细胞外分泌，排出的谷氨酸可达总游离氨基酸的92%左右。,（二）核苷酸分泌,核苷酸是不易分泌出细胞外的，实验证明Mn2+对产氨短杆菌核苷酸分泌起关键作用。Mn2+可引
43、起细胞形态的变化，在IMP发酵中，控制Mn2+（限量）造成细胞膨胀的不规则形态，膜产生异常，非常专一性的膜透性被破坏，核苷酸生物合成补救途径酶系PRPP激酶、Hx（次黄嘌呤）焦磷酸化酶及Hx和R5-P都分泌于体外，在体外大量生物合成IMP。但当Mn2+过量时，菌体呈小球状，抑制了这些物质的分泌。IMP和XMP都是糖磷酸酯，仅在嘌呤残基2值上有无羟基之别。产氨短杆菌在Mn2+过量下生长，IMP完全没有分泌，但XMP分泌性却很好。Mn2+限量时，细胞脂肪酸含量提高，该机制尚未清楚，最近也有报导抗生素、表面活性剂等物质可调节膜的核苷酸分泌。,（三）蛋白质（酶）的分泌,不论是原核还是真核生物，在细胞质
44、内合成的蛋白质需定位于细胞的特定区域或者分泌出胞外。也就是说，基因表达不仅是把DNA转录成RNA，RNA翻译为蛋白质，还要实现把合成的蛋白质精确地输送或分泌到位。这是近年来分子生物学研究的一个十分活跃的领域。因为这不仅是一种基因表达调控的理论，而且与生物工程工业化生产有关，也就是说不仅要解决基因高效表达，还要解决其产物分泌；这是当前基因工程、生物工程急需解决的问题。,1、信号顺序被翻译为信号肽，信号肽一旦出现就会引导核糖体到膜上。2、信号肽在膜上可识别一个或多个受体蛋白，通过氨基酸末端的碱性区与膜带负电荷的内面受体蛋白结合。3、当新生肽正在跨越膜时，信号序列和其后的肽段折成两个短的螺旋酶，并曲
45、成一个反向平行的螺旋发夹，该发夹结构可插入到疏水的脂质双层中。4、蛋白质翻译时信号序列的疏水核心不断插入膜中，直至切点露出膜外侧为止，于是在膜中形成一个孔眼或隧道，一旦分泌蛋白的N端酶在膜内，后续合成的其它肽段部分将顺利利用膜中形成孔眼或通道顺利迈过膜。,5、新生肽链通过此孔眼被输出，当蛋白质部分或全部被输出后，信号肽就被一种特异蛋白酶（即信号肽酶）切割，该酶的切点是在信号肽和分泌蛋白之间。6、转运完成时，受体蛋白即自由扩散入膜平面。 由此可见，疏水的信号肽对新生肽链跨越膜及固定在膜上，是起一个拐棍作用。没有信号肽及其穿膜转化，蛋白质就只能在膜内不能向外分泌。这种蛋白质分泌是在翻译的同时被输出
46、的，称翻译同步分泌，还有翻译后分泌，即蛋白质在合成后才穿过膜，但也没通过信号肽的作用。,分泌的启动和抑制的调控，目前只知与一种称为信号识别颗粒(Signal recogention particle简称SRP)有关。其作用是能与核糖体结合，并停止蛋白质合成，它阻止翻译发生在肽链延长至约70氨基酸残基长度时，这个长度正好是信号肽完成从核糖体出来时的长度（跟随信号肽后的3040个氨基酸残基，此时被埋在核糖体内）。SRP对翻译起负调节作用，由于SRP暂时中止这些分泌蛋白的翻译，能确保这些蛋白质未达到细胞膜或内膜之前不能完成翻译。这样在信号肽和SRP的共同作用下，使得这些分泌蛋白能及时完成转运和分泌，
47、避免在细胞内积累。,二、代谢产物分泌的控制,前边我们已经在代谢产物分泌中谈到氨基酸、核苷酸、蛋白质等产物的分泌是通过改变膜的透性来实现的。本节主要环绕改变膜的透性改变的几种调节方式。,（一）膜脂质组成或含量,（二）改变细胞壁结构来提高膜透性,1、肽聚糖的合成，肽聚糖的重复基本单位是N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰胞壁酸和肽链三部分组成（1）UDP-GlcNAc的合成（2）UDP-N-乙酰胞壁酸合成：（3）UDP-N-乙酰胞壁酸-五肽的合成,（4）组装和运载，N-乙酰胞壁酸-五肽和N-乙酰氨基葡萄糖是在细胞中合成的，在细胞膜上组装并被运送到细胞膜外组成新壁。这两个过程涉及一个非常重要的糖基载体脂（Glycosyl Carrier Lipid ）简称GCL；因为它参与G-菌脂多糖分子的侧链（即抗原决定部分）的合成，所以也称抗原载体脂（Antigen Carrier Lipid)简称ACL 。它是细菌萜醇，其结构式为含有11个异戊二烯单位。 分子式：,抗原载体脂（antigen carrier lipid ）简称ACL，存在于细胞膜上，它的长的非极性烃链插在脂肪质双分子层的非极性区，而分子的极性末端（磷酸根一端）则是游离状态，作为细胞质水相中的多糖装配单位的受体，并且象手臂一样把它共价结合着，已在细菌胞膜内侧形成的多糖单位转运到膜的外面，组成肽聚糖脂多糖等细胞表层的聚糖复合物。,
