1、DNA 重组技术实验原理、方法和步骤 实验原理 1 DNA 重组技术 重组 DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和 DNA分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤： 1）重组 DNA 分子的构建：即将目的基因（ DNA 或 cDNA 片段）与载体DNA重组，应用 TA克隆方法 ,将 PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了 PCR 过程中使用的热稳定聚合酶 (Taq 酶 )在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸 (A),从而产生一 A-粘性末端的性质 ,设计一种线性载体 ,使之含有一 T-粘性末端 ,可直接插入 PCR产物 ,在DNA 连
2、接酶作用下，目的 DNA 和载体 DNA 连接形成重组 DNA 分子。 2）将重组 DNA 分子转化宿主细胞。 3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主 菌敏感的抗生素，重组 DNA（ TA 克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组 DNA 的细菌。 4）收获扩增后的培养细胞，提取重组 DNA 分子（质粒），并纯化，获得某一基因或 DNA 片段的大量拷贝。 图 1 TA 克隆原理示意图 2质粒 DNA的小量制备 常见的质粒 DNA 提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用
3、的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在 PH 12.012.6 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体 DNA 变性，而共价闭环质粒（ CC）DNA 仍为自然状态。将 pH 调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA 之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体 DNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍为可溶状态。通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体 DNA、 RNA 及蛋白质，质粒 DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒 DNA。 3质粒 DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析 限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：、型。型切点 不固定，型其切割位
4、点在识别位点之外，只有型其特异性切点位置可以控制和预测，可以产生固定的 DNA 片段，基因工程中所用的限制酶均为型限制酶。这类酶的特点是具有能够识别双链 DNA 分子上的特异性核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断 DNA 双链，形成一定长度和顺序的 DNA 片段。选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用已知相对分子量的线状 DNA（ DNA 分子量标志）及未经酶切的重组环状质粒为对照，可以对重组环状质粒中的目的 DNA 分子进行初步鉴定 以下 所有实验，进行前请认真阅读试剂使用 说明书 。 一 RNA 反 转录 cDNA 实验 原理： RT-P
5、CR 是将 RNA 的反转录（ RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（ PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA，再以 cDNA 为模板，扩增合成目的片段。 RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中 RNA 病毒的含量和直接克隆 特定基因的 cDNA 序列。作为模板的 RNA 可以是总 RNA、 mRNA 或体外转录的 RNA 产物。 实验 材料： 试剂盒： Takara PrimeScript RT reagent Kit 实验 步骤： 实验所用枪头， EP 管，水等全部使用 RNase free 耗材，或者提前使用 DEPC 处理
6、。处理方式：按照 1/1000 比例向无菌水中加入DEPC，将所需耗材在含 DEPC 的水中浸泡过夜；次日早晨高压灭菌处理。 提前调水浴锅至 42 ； 按下列组份配制 RT 反应液 (反应液配制请在冰上进行 ) 。 5PrimeScript Buffer(for Real Time) 2 l PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 l Oligo dT Primer(50 M) 0.5 l Random 6 mers(100 M) 0.5 l Total RNA 360ng RNase Free dH2O up to 10 l total 10l 轻柔 吹打 均匀； 室
7、温放置 10min； 42 水浴锅中放置 1h； 冰中冷却 2min； 注意事项： 上述反应可根据条件在 PCR 仪中进行。 当 需要使用的基因编码的 RNA 二级结构较为复杂时 ,反转录 前 ,将 RNA 溶液于 65C 加热 5 分钟后迅速置于冰中 ,利用这种办法可以减弱二级结构的影响 ,提高逆转录反应效率。 二 目的基因扩增 ： 引物设计原则： a) 特异性：在 cDNA 中能且只能扩增出目的序列，不会扩增出其他序列；（通过 blast 检验） b) 在引物 5 端添加酶切位点及 3 个保护碱 基 ； c) 酶切位点使用所选载体中有的位点，尽量避免使用载体中相邻的位点 ，尽量避免使用平末
8、端位点 ；所选位点在扩增目的片段中不能出现，可以使用 primer premier 对序列中的酶切位点进行分析。 d) 设计引物时建议同时设计合成两对或两对以上引物，以免一对引物扩增失败时，再合成第二对引物浪费时间。 三 PCR 反应 ： 实验原理： PCR 技术的基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性-退火 -延伸三个基本反应步骤构成： 模板 DNA 的变性：模板 DNA经加热至 93左右一定时间后，使模板 DNA双链或经 PCR扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板 DNA 与
9、引物的退火 (复性 )：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸： DNA 模板 -引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下， 以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性 -退火 -延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2 4 分钟， 2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 (Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 实验材料： dNTP,PCR
10、buffer,DNA 聚合酶，上游引物，下游引物，纯水，模板。 操作步骤： 拿到新合成的引物后， 按照引物说明书离心，溶解引物至 100Mm。使用时稀释至 10mM。将（ Tm-5）作为退火温度进行 PCR 反应并对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。如果存在非特异条带， 一般会设置退火温度梯度，摸索最适退火温度。 （ Tm-5）不是一个普适的规律，最好不要太依赖。 4k 以下的片段使用 KOD Plus DNA 聚合酶， 4k 以上选择 KOD FX DNA聚合酶，按说明书操作 即可 ； 如果 4k以下的片断用 KOD Plus 扩增效果不佳，可以换用 KOD FX。 四 PCR 产物 回
11、收 ： 实验原理： 在高盐状态下，纯化树脂专一性地吸附 DNA；而在低盐或水溶液状态下， DNA 被洗脱下来。 实验材料： OMEGA cycle-pure kit,OMEGA gel extraction kit 取 5 微升 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，如果产物为单一条带，且大小符合预期，直接进行 PCR 产物回收。 如果存在非特异条带，可以考虑进行胶回收，或者继续优化 PCR反应条件。 配制 1%琼脂糖凝胶：称取一克琼脂糖，加入 100ml TAE 溶液中，煮沸至凝胶完全溶解。待温度降至 60C 左右时 (刚好不烫手 )加入 10l 4S green，摇匀，将凝胶溶液倒入槽内，冷
12、凝后备用。 将反转录样品与 Loading Buffer混匀，加入凝胶孔内，最右端加Marker，固定电压 180V，跑 20分钟 左右。此时调水浴锅 60C . 操作步骤： 参考意见： 500bp 以下的片段使用 2%琼脂糖凝胶； 500bp 以上使用 1%琼脂糖凝胶。标准并不绝对，可以根据个人经验进行调整。 在紫外灯下切下相应大小的 DNA 片段，加入 EP 管内， 按照 0.1g凝胶 加入 100l 的比例加入 buffer xp，放入 60C 水浴锅中至胶完全融化。这段时间组装收集管与吸附柱，并在吸附柱上做好标记。 紫外照射时间不宜过长， 避免 DNA 形成 TT 二聚体。 用大枪将
13、EP 管内溶液吹匀，吸入吸附柱中， 12000rpm 离心1min； 倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入 300l buffer XP，最高速离心 1min， 倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入 700l wash buffer，最高速 离心 1min； 重复上一步骤。 最高速空转 2min； 取出吸附柱，放入新离心管中， 70加热 2min，待乙醇挥发； 向吸附柱中加入 50l 超纯水， 70加热 2min， 12000rpm 离心1min，离心管内液体即所需回收的 DNA 溶液。 五 PCR 产物与载体的酶切 实验原理： 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内
14、或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类 :类、类、类。类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰 (甲基化 )作用且依赖于 ATP 的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而类酶在识别位点上切割 DNA 分子，然后从底物上解离。类由两种酶组成 : 一种为限制性内切核酸酶 (限制酶 )，它切割 某一特异的核苷酸序列 ; 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。绝大多数类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列 (如 EcoR识别六个核苷酸序列 :5- G AAT
15、TC-3)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的 DNA 段 (如 Sma :5-CCC GGG-3);有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的 DNA 段称粘性未端，如 EcoR切割识别序 列后产生两个互补的粘性末端。 5 G AATTC 3 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5 3 CTTAA G 5 DNA 纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受 RNA 或单链 DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时
16、，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度 的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚 /氯仿抽提，加 0.1 倍体积 3mol/L NaAc 和 2倍体积无水乙醇，混匀后置 -70低温冰箱 30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 操作步骤： 使用 takara quick cut 限制酶 或常规限制酶 ，酶切体系及条件见相应酶的 说明书 。 Buffer 5 l Buffer 5 l 酶 1
17、 1 l 酶 1 1 l 酶 2 1 l 酶 2 1 l 载体 1 g 外源片段 1 g 水 补至 50 l 水 补至 50 l 温度根据所用不同酶确定，反应时间一般 10min。 注意事项： 双酶切时，两种限制酶反应温度不一致时，可以采用两种方法解决： 1 向体系中加入两种限制酶，先在低温下进行反应，再用较高温度下进行反应 2 先加入一种限制酶，使用相应反应温度进行反应，再加入第二种酶，使用第二种酶的温度进行反应 双酶切时，两种限制酶反应 buffer 不一致时，可以采用两种方法解决： 1 进行两次酶切，两次酶切之间回收 PCR 产物； 2 先使用盐离子浓度较低的 buffer 进行第一次酶切 ，然后加入相应的限制酶和盐离子，继续进行第二次酶切。 六 连接： 实验原理： DNA 连接酶催化相邻的核酸分子间 3 -羟基和 5-磷酸基形成磷酸二酯键 . 当两条单链的寡核苷酸与同一条靶序列完全互补配对时 ,DNA 连接酶可催化一条寡核苷酸 3 -羟基末端和另一条寡核苷酸 5-磷酸末端通过磷酸二酯键连接；如果一条寡核苷酸 3 -羟基末端的碱基出现了突变错配 ,DNA 连接酶就连接不上 ,不催化磷酸二酯键形成 . 实验材料： NEB DNA ligase 体系中外源片段与载体的分子数比例控制在 1:11： 10 之间。对
