1、本科毕业论文系列开题报告生物技术10种形态相似川茶花品种的分子鉴定一、选题的背景与意义茶花CAMELLIAJAPONICAL为山茶科THEACEAE山茶属CAMELLIA常绿灌木或小乔木的统称，是我国十大名花之一，其花姿丰盈、高雅，树高可达34米，树干平滑无毛，大多数花重瓣鲜艳美丽，具有很高的观赏和生态价值，在盆栽和园林绿化中广泛应用，国内茶花年产值已超过30亿元。在长期的发展过程中，由于茶花品种间自然或人工杂交，使得很多品种的花色花型、外部形态极其相似，品种间很难区分，这给川茶花品种分类和杂交育种亲本选配等工作带来很大困难，搞清相似品种间的遗传差异，对茶花品种的鉴别及育种工作具有重要意义。I
2、SSRINTERSIMPLESEQUENCEREPEAT是一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记技术，由ZIETKIEWIEZ等在1994年创建，它具有多态性高、稳定性强、检测方便、成本低等特点，因此在植物的品种鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱的构建等方面得到了广泛的应用。本研究建立茶花基于ISSR标记的分子鉴定方法，利用ISSR标记对外部形态特征极其相似的茶花品种进行品种间鉴定，为相似品种间的准确区分提供依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1研究的基本内容茶花DNA的提取方法研究ISSR引物筛选研究扩增条件的建立研究利用建立的ISSR分子标记对4组外部形态特征极其相似的茶花品种进行品种间
3、分子鉴定。2解决的主要问题（1）ISSR引物筛选；（2）形态特征极其相似的茶花品种的ISSR分子分析。三、研究的方法与技术路线研究方法1材料的处理将采回的新鲜山茶叶片用纸包好，做好记录，放入袋中用变色硅胶干燥。2DNA的提取用改良的CTAB法提取材料叶片中的DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量与浓度。提取的DNA稀释后20保存备用。3ISSRPCR31引物设计通过阅读相关文献，挑选出适合该实验的引物，从某生物公司订购。32引物筛选筛选电泳条带清晰且重复性好的引物。33PCR确定PCR反应体系，用PCR仪进行扩增反应。PCR产物用3的琼脂糖凝胶电泳。用凝胶成像系统观察，拍照，获得电泳图。4数据
4、分析观察得到的条带是否具有多态性，计算出多态性条带比例，以及几种相似茶花的遗传相关系数。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年11月2011年1月1、实验前的准备工作查找资料，写开题报告和论文综述；2、开始翻译外文文献。2011年2月2011年3月1、茶花DNA的提取2、ISSR引物筛选研究3、扩增条件的建立4、对形态特征极其相似的茶花品种进行品种间分子鉴定5、完成外文文献翻译。2011年4月2011年5月1、分析相关数据，整理试验结果，补充完善相关实验；新鲜茶花叶片变色硅胶干燥CTAB法提取DNA电泳测DNA纯度与浓度稀释过的DNA20保存备用ISSR引物设计ISSR引物筛选ISSRPC
5、R反应条件优化进行PCR条带扩增PCR结果跑电泳、拍照品种的分子鉴别2、论文写作及修改。五、主要参考文献1ZIETKIEWIEZE,RAFALSKIA,LABUDADGENOMEFINGERPRINTINGBYSIMPLESEQUENCEREPEATSSRANCHOREDPOLYMERASECHAINREACTIONAMPLIFICATIONJGENOMICS,1994,2021761832IANDGODWIN,ELISABETHABAITKEN,LAWRENCEWSMITHAPPLICATIONOFINTERSIMPLESEQUENCEREPEATISSRMARKERSTOPLANTGENE
6、TICSJELECTROPHORESIS,1997,18152415283朴红梅,李万良,穆楠等ISSR标记的研究与应用J吉林农业科学,2007,32528304宁静,朱旗,黄建安等ISSR分子标记及其在茶树遗传育种研究中的应用J茶叶科学技术,2008,2585欧阳彩虹,何桥,秦国新等25个菊花品种遗传多样性的ISSR分析J山西农业大学学报自然科学版,2010,3032012046冷言峰,马云芳,何桥等几个槐树植物的ISSR鉴定J西南师范大学学报自然科学版,2007,32683867田青松,韩冰,杨劼等96份雀麦属材料遗传多样性的ISSR分析J中国草地学报,2010,118258倪穗,李纪元,
7、王强20个茶花品种遗传关系的ISSR分析J林业科学研究,2009,2256236299王照兰,杨持,赵丽丽等扁蓿豆不同品系ISSR标记遗传差异和遗传多样性J中国草地学报,2010,1111710赵晓清,王波,王一等利用ISSR分析野生蘑菇与双孢蘑菇的遗传多样性J四川大学学报自然科学版,2009,4641130113411倪穗,田敏,李纪元等红山茶总DNA提取及ITSPCR扩增条件优化研究J浙江林业科技,2007,272161912李延龙,张明,曹秀敏等ISSR分子标记技术在金叶女贞品种鉴定中的应用J安徽农学通报,2008,14223939,3413霍光,李德芳,陈安国利用ISSR分子标记分析4
8、4份红麻种质资源的遗传多样性J安徽农业科学,2009,37219890989214张权党,田华,谢耀坚桉树4个种遗传多样性的ISSR分析J中南林业科技大学学报自然科学版,2010,301121715SUSHMAVERMA,TSRANAGENETICDIVERSITYWITHINANDAMONGTHEWILDPOPULATIONSOFMURRAYAKOENIGIILSPRENG,ASREVEALEDBYISSRANALYSISJBIOCHEMICALSYSTEMATICSANDECOLOGY,20111616于恒秀,王淼,梁国华等ISSR引物鉴定芍药栽培品种之间亲缘关系的初步研究J植物生理学通讯
9、,2006,42227127417段伟,闫文德,乌云塔娜14个杏李品种的ISSR分析及分子鉴别J内蒙古农业大学学报自然科学版,2010,214715318姚明哲,黄海涛,余继忠等ISSR在茶树品种分子鉴别和亲缘关系研究中的适用性分析J茶叶科学,2005,25215315719JOUANNLAI,WEICHENYANG,ANDJUYINGHSIAO,ANASSESSMENTOFGENETICRELATIONSHIPSINCULTIVATEDTEACLONESANDNATIVEWILDTEAINTAIWANUSINGRAPDANDISSRMARKERSBOTBUUACADSIN2001,42931
10、0020谭和平,徐利远,余桂蓉等茶树种质资源ISSR分子标记初步研究J核农学报,2006,20211311521王亨洪,索化夷,杨坚等川渝地区重要野生大茶树遗传多样性的ISSR分析J茶叶科学,2009,29216817222罗晓莹,庄雪影,杨跃生杜鹃红山茶遗传多样性的ISSR分析J热带亚热带植物学报,2007,1529310023潘仙鹏,洪莉,干才连等2个茶花变异种与原种间的ISSR分析J浙江农业科学,2010,229529724朱岩芳,祝水金,李永平等ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用J种子,2010,2555925KOSMANE,LEONARDKJSIMILARITYCOEFI
11、CIENTSFORMOLECULARMARKERSINSTUDIESOFGENETICRELATIONSHIPSBETWEENINDIVIDUALSFORHAPLOID,DIPLOID,ANDPOLYPLOIDYSPECIESJMOLECULARECOLOGY,2005,142415424毕业论文文献综述生物技术ISSR分子标记在植物研究中的应用概况摘要文章介绍了ISSR分子标记技术的原理及特点，用ISSR分子标记技术实验的基本研究方法，以及ISSR分子标记技术在不同植物种质资源研究中的应用现状等。最后，对ISSR分子标记技术在植物种质资源研究方面的发展做了展望。关键词ISSR；分子鉴定；遗传
12、多样性；品种鉴定；应用ISSRINTERSIMPLESEQUENCEREPEAT是一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记技术，由加拿大蒙特利尔大学ZIETKIEWIEZ等1在1994年创建，它的基本原理是在SSR的3或5端锚定24个碱基做引物，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的INTERSSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。1ISSR分子标记的特点ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成
13、本降低2，且多态性更丰富；与RAPD相比，ISSR重复性高，稳定性好，同时具备RAPD的简便、易操作等特点；与RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高3,4。因此在多种植物的品种鉴定、遗传多样性分析、基因定位、遗传图谱的构建等方面已得到了广泛的应用。2ISSR基本研究方法21基因组DNA的提取与检测取收集到的几种相似茶花的叶片干燥后，用改良的CTAB法514提取叶片DNA，NDA通常不用纯化，但需用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量与浓度，浓度需相同。稀释后20保存备用。22PCR扩增根据相关文献设计多条PCR引物，由上海生物公司合成。拿到引物后进行预实验，进行引物
14、筛选，筛选出扩增带型清晰且重复性好的引物序列做进一步研究。经预实验优化实验条件，以确定最终反应条件，即PCR反应体系及PCR扩增程序。PCR产物在3的琼脂糖凝胶上120V电压下电泳约15H后，用凝胶成像系统拍照保存。23结果分析根据得到的电泳图，人工读取上面的条带，然后把有条带记为1，无条带记为0，建立原始矩阵。随后采用P0PGEN32软件分析数据，分别获得茶花品种间的多态性位点数、多态性位点率PPL、NEIS基因多样性指数H、遗传相似系数HS等8,15。再用NTSYS210软件基于NEIS无偏估计的遗传相似性按UPGMA法进行品种间的聚类分析，绘制出品种间的亲缘关系树状图，由此将品种分类。3
15、ISSR分子标记在植物种质资源研究中的应用ISSR分子标记技术在植物种质资源研究方面的应用已非常广泛，包括遗传相似性研究、品种鉴定以及遗传图谱的构建等。以下是ISSR分子标记技术在许多不同物种中的应用。31ISSR分子标记在槐树品种鉴定中的应用冷言峰6等人运用ISSR分子技术对香花槐、龙爪槐、刺槐和红花槐4份相似槐树材料进行了品种鉴定和聚类分析，主要目的是鉴别香花槐和红花槐是否“同物异名”。从50条ISSR引物中筛选出19个条带清晰且重复性高的引物，扩增得到了224条带，其中多态性条带214条，占955。结果表明各槐树之间的相似性系数在018091之间，香花槐和红花槐之间的相似系数最大，为09
16、1。4种槐树在DNA分子水平上的差异较明显，据此可初步认为香花槐和红花槐不存在同物异名现象。该实验证明ISSRPCR在品种资源的研究中具有较大的应用潜力，同时也得到ISSR检测出的位点数目较多这个优点。32ISSR分子标记在芍药栽培品种鉴定中的应用于恒秀16等人采用ISSR引物标记技术，初步分析了8个芍药栽培品种莲台、紫霞映雪、妒花魁、粉玉奴、蓝田碧玉、紫金龙、鱼鳞红、合欢娇、红莲等之间的亲缘关系。5条引物共扩增出21条谱带，亲缘指数分析表明蓝天碧玉与其余的七个品种之间的关系较远，其次是粉玉奴。该实验还得出，影响扩增反应结果清晰、准确的主要因素有退火温度、MG2浓度、TAQ酶等，提醒我们在今后
17、的实验中可特别注意这几个因素。33ISSR分子标记在桉树遗传多样性中的应用张党权14等人以桉树的赤桉、巨桉、细叶桉和粗皮桉4个主要栽培种的L8个种源作为研究材料，根据优化的ISSRPCR反应体系和扩增条件，从100条引物中筛选出12条扩增条带特异、条带数适中、背景清晰、重复性好的引物，总计扩增出120条清晰可重复的DNA条带，其中93条是多态性条带。每个引物可扩增的多态条带长度范围为3002500BP，数目在411条，平均为775条，多态带百分率为775。NEI遗传距离和遗传一致度的结果表明，遗传一致度的变化范围在0387109140之间，遗传距离的变化范围在0089909491之间，桉树4个
18、种的种间遗传相似性差异较大，种内遗传相似性极高。34ISSR分子标记在杏李品种上分子鉴定的应用段伟17等人采用ISSR分子标记,对14个杏李品种进行了遗传多样性分析,从100条ISSR引物中筛选出多态性较高的22条引物，对14个杏李品种进行扩增,共扩增出205个位点,其中特异性位点168个，多态性位点比率为8195；聚类分析结果表明14个杏李品种中味馨与其它品种之间平均遗传距离最大,风味玫瑰与味厚之间遗传距离最小UPGMA聚类分析可将14个供试品种分为两大类,即味馨单独为1类,其他品种聚为第2类。35ISSR分子标记在茶树上的应用姚明哲、黄海涛等18利用筛选出的8个ISSR引物对六个茶树品种的
19、基因组DNA进行扩增。共扩增出99条带，其中多态性条带82条，多态性为796。NEILI系数分析结果表明，供试品种的相似系数在0535到0735之间，可将6个品种聚为两类，茂绿、翠峰、青峰、迎霜和劲蜂聚为一类，龙井43单独聚成一类。JOUANNLAI等19应用RAPD及ISSR技术分析台湾地区引进的品种和台湾野生茶树共37个样本，结果表明RAPD不能区分所有样本，而ISSR可以区分所有样本。谭和平20等采用100个ISSR引物对32个茶树资源的DNA进行PCR扩增反应，初步建立32个茶树资源的ISSR分子指纹图谱。王亨洪21等人利用ISSR分子标记技术对四川、重庆等地12份重要的野生大茶树资源
20、的遗传多态性进行了分析。7条多态性引物共扩增出146条扩增带，其中139条为多态性带，多态位点百分比为952。根据在相同迁移位上有扩增带记为1、无带记为0的方法构建矩阵，然后用软件分析。经软件分析得到供试品种间的相似系数介于037071，平均为051，基因H和SHANNON信息系数分别为020和034。在此基础上建立了聚类分析树状图，将其12个品种划分成了3大聚类组。通过以上可知，ISSR分子标记技术在茶组植物的品种鉴定、种质资源分析、遗传多样性分析等方面已经有了广泛的应用。36ISSR分子标记在茶花上的应用罗晓莹22等运用ISSR分子标记技术，利用筛选出的10条ISSR引物，对珍稀濒危植物杜
21、鹃红山茶的2个亚种群60个单株的遗传多样性进行了研究。结果显示杜鹃红山茶的遗传多样性较低，亚种群间遗传分化较小。倪穗8等采用ISSR分子标记技术对国内外具有代表性的20个茶花品种进行了品种间遗传关系的分析，从60条随机扩增引物中筛选出了2L条谱带清晰且重复性好的引物序列，共扩增出153条扩增带，其中多态性条带146条，多态位点百分比为954。用软件进行品种间多样性分析得出20个供试品种间的遗传相似系数HS介于050074之间，平均值为063。结合茶花形态学特征与UPGMA聚类分析结果，可将20个茶花品种分为2个大类群。潘仙鹏23等采用ISSR分子标记技术对2种茶花品种及其变异新品种进行了遗传多
22、样性分析，所选用的100个引物中有12个产生了较为清晰有效、重复性好的条带。12个引物共扩增出110条带，其中8个引物可扩增出多态性条带，但只有13条特异性条带，多态位点百分率为118。该实验虽然得到了较低的多态性，但仍说明了茶花变异品种和原种间具有一定的遗传变异。ISSR分子标记技术在茶花的种质资源研究及品种间遗传多样性分析中已有了一定的应用，只是相关的文献还是不多，相信随着今后ISSR分子标记法更广泛的应用，在这方面的研究一定也会越来越多的。4展望ISSR作为一种新型的DNA分子标记技术，在植物种质资源研究尤其是种质资源鉴定、遗传多样性分析和亲缘关系及基因定位等方面得到了较为广泛的应用24
23、，而且与其他分子标记技术相比优势也较为突出。然而，ISSR分子标记技术还是存在一些不足的，例如其呈孟德尔遗传，为显性标记，不能区分纯合体与杂合体25。在扩增条带有无的判读上受人为主观因素影响较大，不同的人的判读结果不一定一致，如何减少人为因素的影响，使其尽可能的公正客观是其改进的方向。此外，ISSR虽然已经广泛用于植物种质资源鉴定的研究，但是由于目前仍缺乏标准的DNA指纹图谱库，还不能大规模广泛应用于作物品种真实性和纯度鉴定17。相信随着分子生物学和生物信息学技术的不断发展和改进，ISSR分子标记技术凭借其简便、经济、快速、多态性高、稳定性强等优点将越来越得到广泛使用，特别是应用于大批量样品的
24、研究，为植物种质资源研究以及遗传多样性分析方面发挥更大的作用。参考文献1ZIETKIEWIEZE,RAFALSKIA,LABUDADGENOMEFINGERPRINTINGBYSIMPLESEQUENCEREPEATSSRANCHOREDPOLYMERASECHAINREACTIONAMPLIFICATIONJGENOMICS,1994,2021761832IANDGODWIN,ELISABETHABAITKEN,LAWRENCEWSMITHAPPLICATIONOFINTERSIMPLESEQUENCEREPEATISSRMARKERSTOPLANTGENETICSJELECTROPHORE
25、SIS,1997,18152415283朴红梅,李万良,穆楠等ISSR标记的研究与应用J吉林农业科学,2007,32528304宁静,朱旗,黄建安等ISSR分子标记及其在茶树遗传育种研究中的应用J茶叶科学技术,2008,2585欧阳彩虹,何桥,秦国新等25个菊花品种遗传多样性的ISSR分析J山西农业大学学报自然科学版,2010,3032012046冷言峰,马云芳,何桥等几个槐树植物的ISSR鉴定J西南师范大学学报自然科学版,2007,32683867田青松,韩冰,杨劼等96份雀麦属材料遗传多样性的ISSR分析J中国草地学报,2010,118258倪穗,李纪元,王强20个茶花品种遗传关系的ISS
26、R分析J林业科学研究,2009,2256236299王照兰,杨持,赵丽丽等扁蓿豆不同品系ISSR标记遗传差异和遗传多样性J中国草地学报,2010,1111710赵晓清,王波,王一等利用ISSR分析野生蘑菇与双孢蘑菇的遗传多样性J四川大学学报自然科学版,2009,4641130113411倪穗,田敏,李纪元等红山茶总DNA提取及ITSPCR扩增条件优化研究J浙江林业科技,2007,272161912李延龙,张明,曹秀敏等ISSR分子标记技术在金叶女贞品种鉴定中的应用J安徽农学通报,2008,14223939,3413霍光,李德芳,陈安国利用ISSR分子标记分析44份红麻种质资源的遗传多样性J安徽
27、农业科学,2009,37219890989214张权党,田华,谢耀坚桉树4个种遗传多样性的ISSR分析J中南林业科技大学学报自然科学版,2010,301121715SUSHMAVERMA,TSRANAGENETICDIVERSITYWITHINANDAMONGTHEWILDPOPULATIONSOFMURRAYAKOENIGIILSPRENG,ASREVEALEDBYISSRANALYSISJBIOCHEMICALSYSTEMATICSANDECOLOGY,20111616于恒秀,王淼,梁国华等ISSR引物鉴定芍药栽培品种之间亲缘关系的初步研究J植物生理学通讯,2006,42227127417
28、段伟,闫文德,乌云塔娜14个杏李品种的ISSR分析及分子鉴别J内蒙古农业大学学报自然科学版,2010,214715318姚明哲,黄海涛,余继忠等ISSR在茶树品种分子鉴别和亲缘关系研究中的适用性分析J茶叶科学,2005,25215315719JOUANNLAI,WEICHENYANG,ANDJUYINGHSIAO,ANASSESSMENTOFGENETICRELATIONSHIPSINCULTIVATEDTEACLONESANDNATIVEWILDTEAINTAIWANUSINGRAPDANDISSRMARKERSBOTBUUACADSIN2001,429310020谭和平,徐利远,余桂蓉等茶
29、树种质资源ISSR分子标记初步研究J核农学报,2006,20211311521王亨洪,索化夷,杨坚等川渝地区重要野生大茶树遗传多样性的ISSR分析J茶叶科学,2009,29216817222罗晓莹,庄雪影,杨跃生杜鹃红山茶遗传多样性的ISSR分析J热带亚热带植物学报,2007,1529310023潘仙鹏,洪莉,干才连等2个茶花变异种与原种间的ISSR分析J浙江农业科学,2010,229529724朱岩芳,祝水金,李永平等ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用J种子,2010,2555925KOSMANE,LEONARDKJSIMILARITYCOEFICIENTSFORMOLECULA
30、RMARKERSINSTUDIESOFGENETICRELATIONSHIPSBETWEENINDIVIDUALSFORHAPLOID,DIPLOID,ANDPOLYPLOIDYSPECIESJMOLECULARECOLOGY,2005,142415424本科毕业设计（20_届）10种形态相似川茶花品种的分子鉴定目录1引言22材料与方法321样品采集322实验设备323DNA提取324引物筛选与ISSR反应条件43结果与分析531ISSR引物的筛选532扩增产物的多态性533品种鉴定5331氅盔和吊金钟的分子鉴别5332胭脂莲、胭脂鳞、鱼鳞甲的分子鉴别7333泸州大红和泸州二红的分子鉴别933
31、4红佛鼎、似紫冠以及紫金冠的分子鉴别104讨论115小结12致谢错误未定义书签。参考文献12摘要本实验采用ISSR分子标记技术，对重庆南山植物园中花色花型极其相似，从外部形态上难以区分的10个川茶花品种进行了分子鉴定。从23条引物中筛选出了5条谱带清晰、重复性好的引物用于PCR扩增，共得到72条清晰条带，其中64条呈现多态性，多态性比例P为8889。利用5条引物所建立的DNA指纹图谱可以较好地区分出这10个茶花品种，除了似紫冠和紫金冠。实验结果表明ISSR分子标记具有丰富的遗传多样性和稳定性，是一种较好的遗传分子标记，适合用于茶花品种的鉴定。关键词山茶；品种；分子鉴定；ISSRABSTRACT
32、INTHEPRESENTSTUDY,ISSRMARKERSHAVEBEUSEDTOMOLECULARLYIDENTIFIED10SICHUANCAMELLIASPECIESOFBOTANICALGARDENINNANSHANCHONGQING,WHICHAREVERYSIMILARINCOLORANDPATTENANDINDISTINGUISHABLEFROMTHEEXTERNALMORPHOLOGY5PRIMERSWHICHHAVEDISTINCTANDWELLSEPARATEDBANDSWERESCREENEDFROM23PRIMERSUSEDFORPCRAMPLIFICATIONANDR
33、EVEALED72CLEARBANDS,OFWHICH64WEREPOLYMORPHIC,ACCOUNTINGFOR8889THEDNAFINGERPRINTINGESTABLISHEDBYTHESE5PRIMERSCANWELLDISTINGUISHTHE10CAMELLIASPECIESEXCEPTTHESIZIGUANANDZIJINGUANTHERESULTOFEXPERIMENTSHOWTHATISSRHASAEXTENSIVEGENETICDIVERSITYANDSTABILITY,ANDISAGOODGENETICMOLECULARMARKERFORSPECIESIDENTIFI
34、CATIONINCAMELLIAKEYWORDSCAMELLIASPECIESMOLECULARIDENTIFICATIONISSR1引言茶花CAMELLIAJAPONICAL为山茶科THEACEAE山茶属CAMELLIA常绿灌木或小乔木，是我国十大名花之一1。川茶花在中国茶花中独具一格，它树姿挺拔秀丽，叶片终年长青，严冬顶霜怒放，既可以盆栽观赏，又可以植于街边路旁美化环境。川茶花开花时，花朵或洁白如云，或红花似火，单瓣清纯委婉，重瓣交叠生姿，平瓣落落大方，曲瓣高歌狂舞，深受人们的喜爱。过去我们把川茶花归属在华东山茶品系中。已故上海著名园艺家黄德邻老先生有一个著名论断“中国茶花起源于青藏高原，
35、后来分南北两支，南支发展为云南山茶，北支发展为四川山茶，此后四川山茶沿长江流域向东发展，又形成了华东山茶。这样就形成了四川山茶、云南山茶和华东山茶三大体系。”也就是说中国的山茶是以川茶为主的长江流域的山茶种，古名为“川茶”或“蜀茶”，它是同我国的“滇茶”同出源于世界的屋脊青藏高原。世界茶花最集中的产地是在中国，千万年来中国这个山茶种逐渐地沿长江，由上游向下游传播开来，直至东海诸岛屿，例如人们看到的舟山茶林。中国山茶种在千百年前已自然形成了多色多型的重瓣种。在四川，我们的祖先早就把它们种植在庭院里，作为高贵的观赏植物，后来又经过前人的长期栽培成为当今世界上最古老的，但又是进化了的名贵中国“川茶”
36、种2。总的来说，川茶花、华东茶花和一些日本茶花都叫日本山茶，但簇叶稍有不同。川茶花的叶片椭圆形，圆满而略呈卵状，光滑而有光泽，叶脉的网状不很明显，叶边呈小锯齿状。日本茶花虽然也呈椭圆形，但叶端有尖顶，叶面不光滑，叶脉网状明显，叶边锯齿形。川茶花和华东茶花也有所不同。华东茶花的叶片较薄有光泽，主脉、侧脉及网脉细腻明显，锯齿细尖锐。四川什邡茶花协会老会长、川茶花专家徐永才先生在川茶花品种及其演进一文中对川茶花的特点说得更清楚。他说“茶花在四川立地条件的长期影响下，形成了川茶花的明显特征1、较外地茶花生长缓慢，节间短，着叶密集；2、叶片以椭圆形和卵圆形为主，很少见到外地茶花的“长椭圆形”叶片；3、叶
37、片亮绿色，叶脉不外凸而隐平于叶面，叶缘近似波状，波端仅有微齿，齿长03MM以内；4、文瓣品种多；5、由于原始种源多而形成了花朵组成基数幅度大的多品种群体；6、有色泽鲜艳、复色多的品种。”由于四川盆地常年湿润多雨，相对湿度大，全日照天数不多，川茶花在这种特殊的地理环境的逐代孕育下，形成了山茶花家族中的“川茶”品系，是理所当然的。据统计川茶花共有87个品种，但在长期的发展过程中，由于其品种间的自然或人工杂交，使得很多品种的花色花型、外部形态极其相似，品种间难以区分，这给川茶花品种分类和杂交育种亲本选配等工作带来了很大困难。搞清相似品种间的遗传差异，对茶花品种的鉴别及育种工作具有重要意义。ISSRI
38、NTERSIMPLESEQUENCEREPEAT是一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记技术，由ZIETKIEWIEZ等3在1994年创建，它的基本原理是在SSR的3或5端锚定24个碱基做引物，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的INTERSSR区域的多个条带，通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。认识到生物个体之间DNA序列差异并以此作为标记的分子技术研究始于1980年，之后随着分子生物学的发展，DNA分子标记技术也得到了迅速发展，目前应用于植物种内遗传多样性研究的DNA分子标记主要有RAPD
39、、AFLP、SSR和ISSR标记等几种4，其中ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低了不少5，且多态性更丰富；与RAPD相比，ISSR重复性高，稳定性好，同时具备RAPD的简便、易操作等特点；与AFLP相比，ISSR更快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高。因此在多种植物的品种鉴定、遗传多样性分析、基因定位、遗传图谱的构建等方面已得到了广泛的应用36。本研究利用ISSR标记对10个形态相似的川茶花品种进行品种间分子鉴定，旨在为相似茶花品种间的快速准确的辨别提供科学有效的方法。2材料与方法21样品采集实验材料
40、均采自重庆南山植物园，共10个品种，分别为氅盔、吊金钟、胭脂莲、胭脂鳞、鱼鳞甲、泸州二红、泸州大红、红佛鼎、似紫冠以及紫金冠。采集嫩叶，用变色硅胶干燥后带回实验室，4冰箱中保存直至提取DNA。实验中选取茶花叶片作为DNA提取材料。从形态上观察到氅盔和吊金钟之间相似程度较高，胭脂莲、胭脂鳞和鱼鳞甲之间相似程度较高，泸州大红和泸州二红之间相似程度较高，红佛鼎、紫金冠以及似紫冠之间相似程度较高（见表1）。因此可将待测的10个川茶花品种从形态上初步分为4组。表1参试茶花品种TABLE1TESTEDCAMELLIACULTIVARS序号CODE品种名CULTIVAR采样地点SAMPLINGSITES起源
41、PARENT12345678910氅盔吊金钟胭脂莲胭脂鳞鱼鳞甲泸州二红泸州大红红佛鼎似紫冠紫金冠重庆南山植物园重庆南山植物园重庆南山植物园重庆南山植物园重庆南山植物园重庆南山植物园重庆南山植物园重庆南山植物园重庆南山植物园重庆南山植物园CJAPONICALCJAPONICALCJAPONICALCJAPONICALCJAPONICALCJAPONICALCJAPONICALCJAPONICALCJAPONICALCJAPONICAL22实验设备磨样机（BIOFASTPREP24）、离心机（EPPENDORF5415R）、电泳仪（DYY6C）、全自动紫外与可见分析FR200A、PCR仪GENEA
42、MPPCRSYETEM9700、水浴锅HH4、微型迷你离心机TOMOSMINISTAR。23DNA提取本实验采用改良CTAB法3,715提取川茶花基因组DNA，首先取变色硅胶干燥好的叶片约005克，加入少量PVP粉和一颗磁珠，置入磨样管中，用磨样机（BIOFASTPREP24）研磨，SPEED40，TIME20S。然后迅速加入65预热的2CTAB提取缓冲液8001000ML，摇匀后转入2ML离心管中，65水浴30分钟。冷却至室温，加等体积氯仿异戊醇（241），混合均匀（缓慢颠倒）1530分钟，室温10000RPM离心1015分钟。接着吸取上层水相至2ML离心管中，加入1/10体积的10CTAB
43、，轻轻摇匀，再加入等体积的氯仿异戊醇（241）抽提，混合均匀后离心。离心后取上层水相至2ML离心管中，加入05体积的5MNACL混匀，再加入等体积20预冷的异丙醇，轻轻摇匀，放置2H或过夜。之后再10000RPM离心10MIN，使DNA附着在离心管管底，弃水相。加75乙醇浸洗23次，用无水乙醇清洗一次，去乙醇，风干。提取出来的DNA沉淀用1TE溶解后放入4冰箱中保存备用，并将各样品中的DNA量稀释到相同浓度。通过1琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量。24引物筛选与ISSR反应条件从有关山茶科植物的ISSR研究报道中选取23条引物4,8,16（见表2），由上海生物工程技术服务有限公司合
44、成。表2ISSR引物名称及序列TABLE2THENAMEANDSEQUENCEOFISSRPRIMERS引物序列引物序列IR1AG8CIR13GT8GGIR2CT8GIR14CAG8TIR3AC8TIR15GA8CTIR4AC8GIR16AC8TGIR5AC8CIR17CT8TIR6GA8TIR18CA8AIR7CTC6IR19CAA8GIR8GAA6IR20GGAGA3IR9CAA6IR21CA8GIR10GACA4IR22CT8CIR11GAC8IR23CTGA4IR12GT8C由于ISSR引物对MG2浓度和退火温度要求较高，故参照谈探等人的研究17对MG2浓度和退火温度进行了梯度实验，选
45、定了最佳MG2浓度和各引物的最佳退火温度。经过比较和优化，反应体系确定为20L10BUFFER缓冲液2L，25MMOLL1MGCL216L，5UTAQ酶05L，25MMOLL1DNTP24L，10MOLL1引物24L，1LDNA模板，101L无菌水。PCR扩增程序为，94预变性5MIN；94变性45S，各种温度退火50S，72延伸15MIN，42个循环；72延伸7MIN，4保存。取8L扩增产物，用含有01EB的15琼脂糖凝胶电泳，于120V电压下电泳15H，电泳结果在凝胶成像系统中观察并拍照记录。3结果与分析31ISSR引物的筛选根据预实验结果从中筛选出了5条扩增带型清晰且重复性好的引物序列（
46、见表3），并且选定了各引物的最佳退火温度。表3ISSR引物序列、退火温度以及扩增带数TABLE3THESEQUENCESANDANNEALINGTEMPERATURESOFTHEFIVESELECTEDISSRPRIMERS,ANDTHENUMBERSOFBANDSSCOREDINCAMELLIACULTIVARS引物序列（53）退火温度位点总数多态位点总数多态位点百分率IR6GA8T61616159375IR15GA8CT53112119175IR16AC8TG4811414100IR19CAA8G50312108333IR20GGAGA35641814777832扩增产物的多态性5条ISS
47、R引物对10个川茶花样品共扩增出72条250BP到2000BP之间的条带，其中多态性条带64条，多态位点百分率为8889。5条引物中扩增条带数最少的是IR15和IR19，各有12条，扩增条带数最多的是IR20，有18条，平均每条引物可扩增144条。33品种鉴定利用筛选出的5条引物分别对供试材料进行PCR扩增，并且建立相应的DNA指纹图谱。得到的指纹图谱结果与我们从形态上观察到的结果一样，即氅盔和吊金钟之间相似程度较高，胭脂莲、胭脂鳞和鱼鳞甲之间相似程度较高，泸州大红和泸州二红之间相似程度较高，红佛鼎、紫金冠以及似紫冠之间相似程度较高。331氅盔和吊金钟的分子鉴别氅盔和吊金钟在川茶花中属早花种类
48、，栽培数量少，观赏价值较大，但两者外部形态非常相似。区别仅为氅盔的花色深，花瓣质薄，花径略小成筒状，叶片平展；吊金钟的花色略浅，质厚，花径略大，成喇叭状。氅盔吊金钟图1氅盔和吊金钟的图片从图2中可以看出，5条引物中的4条（分别为IR6、IR15、IR16、IR19）所建立的指纹图谱均能较好地鉴别出氅盔和吊金钟两个品种。如IR6的扩增结果显示氅盔在1800BP、1600BP、1200BP分别存在三条特殊条带，而吊金钟则在1400BP和450BP处存在两条特殊的条带。其他三条引物的扩增结果也表明氅盔和吊金钟为两个独立品种氅盔在IR161200BP、IR161000BP、IR192000BP和IR1
49、91000BP有特殊条带，而吊金钟则在IR151100BP和900BP有特殊条带。这些特殊标记的存在或缺失将氅盔和吊金钟这两个相似品种区分开。从上可见氅盔和吊金钟这两个品种虽然外部形态特征难以区分，花色花型相似，但两者的DNA条带有较大的不同，可以通过以上4个中的任意一个引物将其区别开来，说明它们是两个独立的品种。12M12M（1）（2）12M12M（3）（4）图2供试材料ISSRPCR扩增电泳图谱2000BP1800BP1600BP1200BP1400BP450BP1100BP900BP1200BP1000BP2000BP1000BP（第1、2和M分别为氅盔、吊金钟和MAKER。）（1）为引物IR6,（2）为引物IR15,（3）为引物IR16,（4）为引物IR19扩增电泳图）332胭脂莲、胭脂鳞、鱼鳞甲的分子鉴别胭脂莲、胭脂鳞在川茶花中属一般品种，栽培比较普遍。三者在花型上极其相似，区别在于胭脂莲的叶绿色，花色较胭脂鳞浅，花瓣边缘内扣；胭脂鳞的叶色深绿，花色深红，花瓣沿中脉有白色条块；鱼鳞甲的叶色深绿，花色深红。胭脂莲胭脂鳞鱼鳞甲图3胭脂莲、胭脂鳞、鱼鳞甲的图片图4是胭脂莲、胭脂鳞、鱼鳞甲三个品种通过引物IR20扩增的ISSR指纹图谱。从
