1、本科毕业论文系列开题报告生物技术利用CACO2和THP1共培养模式分析卡拉胶的致炎作用一、选题的背景与意义卡拉胶（也称鹿角藻胶或鹿角菜胶，英文名CARRAGEEN）是存在于海洋红藻纲的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等细胞壁中硫酸多糖，因硫酸基团和内醚键位置不同，现已分为七种类型卡拉胶、和型，其中、和卡拉胶的应用最为广泛。它具有独特的生物学性质，可以制成亲水胶体、凝胶、增稠、乳化、成膜、稳定分散剂等，因此受到食品、日用化工和医药等行业的青睐。近年来，我国已将卡拉胶列入食品添加剂目录，且它也已列入联合国粮农组织和世界卫生组织食用标准用量说明书，其应用前景非常广阔。但是，有研究表明卡拉胶可以引起
2、动物的致炎致癌反应，并能促进结肠上皮细胞产生炎症因子。但由于卡拉胶的致炎机制尚不确定，导致它的使用安全性在国际上存在很大争议。本试验利用CACO2和THP1细胞体外共培养模式，作为肠道炎症研究的细胞模型的基础上，通过ELISA试验检测免疫因子的分泌变化，初步判断能引起免疫反应的卡拉胶的在体内发挥免疫反应的过程。阐明这类物质的使用限度及非安全性来源。研究领域将成为目前国际上关于卡拉胶的致炎模型使用、食品安全评价和海洋藻类多糖应用前景的焦点。本实验的研究结果对推动卡拉胶在食品添加剂行业的重新定位提供帮助，对确定卡拉胶在食品添加剂中的使用种类、使用剂量具有参考价值；而炎症机理的初步探索将为今后进一步
3、研究卡拉胶致炎机理提供新的依据；同时，也给海藻寡糖或多糖在医药领域的应用提供了可开拓的空间和安全性的指导。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1、建立CACO2和THP1细胞共培养模型在体内肠系统中，分布着结肠上皮细胞和人巨噬细胞，当肠道受到致炎物质刺激时，首先表现为肠上皮单层细胞完整性的破坏并导致细胞因子IL8的分泌增加，IL8是一种强而有力的中性粒细胞趋化和活化因子，是介导由TNF引发炎症的主要因子。在炎症因子IL8的刺激下巨噬细胞分泌TNF增加，TNF可诱导结肠上皮细胞凋亡及增加炎症因子表达的作用，从而进一步引发肠道的炎症反应；当在TNF抗体或消炎药物的作用下，检测到IL8和TNF的分泌
4、受到抑制。本研究利用CACO2和THP1细胞共培养模型模仿在体内的肠道炎症，用来研究卡拉胶的致炎作用。2、以炎症相关因子肿瘤坏死因子TNF和白细胞介素8IL8的产生和变化为指标，细胞经不同卡拉胶处理后1）利用ELISA试验（酶联免疫吸附试验定量检测THP1细胞分泌TNF因子的能力和CACO2细胞分泌IL8因子的能力；2）综合分析不同结构的卡拉胶处理后，各因子的变化，评判其致炎机理。3、拟解决的主要问题卡拉胶致炎作用的方式三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1CACO2和THP1细胞共培养模型在MILLICELL上培养CACO2细胞，是CACO2细胞生长成片，形成致密的膜状结构。下层细胞培养板
5、上培养THP1细胞。构建成如下模型空白对照组上层MILLICELL上培养CACO2细胞，下层细胞培养板上饲养THP1细胞，不用卡拉胶样品处理，用ELISA检测上层细胞分泌IL8的情况和下层细胞分泌TNF的情况；实验组上层MILLICELL上培养CACO2细胞，下层细胞培养板上饲养THP1细胞。用卡拉胶样品处理上层CACO2，用ELISA检测上层细胞分泌IL8的情况和下层细胞分泌TNF的情况；阴性对照组上层MILLICELL上培养CACO2细胞，下层细胞培养板上没有细胞，用卡拉胶样品处理上层CACO2，用ELISA检测上层细胞分泌IL8的情况。2用共培养模型分析卡拉胶致炎作用以各炎症相关因子的产
6、生和变化为指标，细胞经不同卡拉胶处理后1）以酶联免疫吸附试验ELISA检测培养液中肿瘤坏死因子TNF和白细胞介素8IL8来检测THP1和CACO2细胞分泌因子的能力；2）综合分析不同结构的卡拉胶处理后，各因子的变化，评判其致炎情况；3）确定易引起炎症损伤的卡拉胶的致炎方式。（二）技术路线卡拉胶样品ELISA检测上层细胞分泌IL8的情况和下层细胞分泌TNF的情况CACO2和THP1细胞共培养模型细胞毒检测四、研究的总体安排与进度2010年11月到2011年01月查阅文献、资料，准备实验中要用的材料和仪器。2011年01月到2011年02月进行实验和外文文献的翻译。2011年02月到2011年04
7、月完成毕业论文。2011年05月准备毕业论文答辩。五、主要参考文献1周革非,邢荣莲,孙利芹,等不同分子量的角叉菜CHONDRUSOCELLATUS卡拉胶的抗氧化活性术J海洋与湖沼,2009,5405455492何新益,殷七荣,张兴全卡拉胶的特性与应用J食品工业,2002,330313周卫国,王文智卡拉胶的生产及应用C学术交流论文,2006,31621644胡亚芹,竺美卡拉胶及其结构研究进展J海洋湖沼通报,2005,1951035袁华茂卡拉胶寡糖与衍生物的制备及生物活性研究C中国科学院海洋研究所,博士论文,20056徐强,管华诗卡拉胶研究的发展及现状J青岛海洋大学学报,1995,S1117124
8、7尚一平卡拉胶的性能及其在肉类工业中的应用J肉类工业,2006,1231328梁国珍,陈文谱卡拉胶特性及其在乳制品加工中的应用J怀化学院学报,2008,253559ARITOFT,DIPSEN,RMADSEN,FETALINTERACTIONBETWEENCARRAGEENANSANDMILKPROTEINSAMICROSTRUCTURALANDRHEOLOGICALSTUDYBIOMACROMOLECULESJ2007,872973610IZYDORCZYK,MCUI,SWWANG,QPOLYSACCHARIDESGUMSSTRUCTURES,FUNCTIONALPROPERTIES,AND
9、APPLICATION,INFOODCARBOHYDRATESMFIRSTDITIONED,CUI,SW,EDTAYLORFENNEMA,OR,ED,MARCELDEKKER,INCNEWYORK,199621125513陶慧娜,孙涛卡拉胶及其衍生物的生物活性研究进展A安徽农业学,2008,197967796814王长云,管华诗多糖抗病毒作用研究进展卡拉胶及其抗病毒作用J生物工程进展,2000,33942,4815CHENGAC，CHENYY，CHENJCDIETARYADMINISRATIONOFSODIUMALGINATEANDKEAMAGEENANENHANCESTHEINNATEIMM
10、UNERESPONSEOFBROWNMARBLEDGROUPEREPINEPHELUSFUSCOGUTTATUSANDRESISTANCEAGAINSTVIBRIOALGINOLYTICUSJVETERINARYIMMUNOLOGYANDIMMUNOPATHOLOGY,2008,12120621516中华人民共和国国家标准食品添加剂一卡拉胶M北京中国标准出版社199417吴剑锋,吴晖,吴涛等几种亲水性胶体凝胶特性研究J广州食品工业科技2004,44618黄来发食品增稠剂M北京中国轻工业出版社,2000,70838419胡坤,赵谋明物理作用力对卡拉胶凝胶体质构特性影响的研究J食品与发酵工业,20
11、03,2565820浮吟梅,王林山卡拉胶在食品工业中的应用A开发应用中国食品添加剂,2009,416016221胡茵,黄宏光,韦曲颖卡拉胶在彩条牙膏中的试验与研究J牙膏工业,2006,1323422宁发子,何新益,殷七荣等卡拉胶的特性与食品应用J食品科技,2002,3363823孟凡玲,罗亮,宁辉等卡拉胶研究进展J高分子通报,2003,10495624周皓5种酶制剂对卡拉胶降解作用的研究J饮料工业,2001,5242725WILCOXDK,HIGGINSJ,BERTRAMTACOLONICEPITHELIALCELLPROLIFERATIONINARATMODELOFNONGENOTOXINI
12、NDUCEDCOLONICNEOPLASIALABINVEST,1992,6740541126CALVERTRJ,REICKSMALTERATIONSINCOLONICTHYMIDINEKINASEENZYMEACTIVITYINDUCEDBYCONSUMPTIONOFVARIOUSDIETARYFIBERSPROCSOCEXPBIOLMED,1988,189455127ARAKAWAS,OKUMUAM,YAMADAS,ETALENHANCINGEFFECTOFCARRAGEENANONTHEINDUCTIONOFRATCOLONICTUMORSBY1,2DIMETHYLHYDRAZINEAN
13、DITSRELATIONTOGLUCURONIDASEACTIVITIESINFECESANDOTHERTISSUESNUTRSCIVITAMINOLTOKYO,1986,3248148528陈方小分子量硫酸多糖卡拉胶衍生物的制备及抗流感病毒活性研究C福州大学,硕士论文,200629MARCUSSN,MARCUSAJ,MARCUSR,ETALTHEPREULCERATIVEPHASEOFCARRAGEENANINDUCEDCOLONICULCERATIONINTHEGUINEAPIGINTJEXPPATHOL,1992,7351552630KITSUKAWAY,SAITOH,SUZUKIY,E
14、TALEFFECTOFINGESTIONOFEICOSAPENTAENOICACIDETHYLESTERONCARRAGEENANINDUCEDCOLITISINGUINEAPIGSGASTROENTEROLOGY,1992,1021859186631ZHOUGF,XINH,SHENGWX,ETALINVIVOGROWTHINHIBITIONOFS180TUMORBYMIXTUREOF5FUANDLOWMOLECULARCARRAGEENANFROMCHONDRUSOCELLATUSPHARMACOLOGICALRESEARCH,2005,5115315732陈海敏,严小军,王峰等不同聚合度的
15、卡拉胶降解物对人结肠上皮细胞的影响J中国食品学报,2009,18993毕业论文文献综述生物技术卡拉胶的应用及安全性研究进展摘要卡拉胶具有能形成高黏度溶液的胶体的性质，又具有一定的稳定性与悬浮性，是最重要的一类应用于食品添加剂的海洋红藻多糖。已有许多相关实验研究证明卡拉胶能够引起人和动物肠道疾病,但是由于卡拉胶引起人体炎症损伤的方式不确定，以及卡拉胶的致炎机理尚不明确，导致它的使用安全性在国际上存在很大争议。故明确卡拉胶的致炎方式及机理，对今后卡拉胶在食品添加剂和小分子量卡拉胶在药物开发等领域中提供安全参考值和理论依据，对食品安全及人类健康具有重要意义。本文将对卡拉胶的理化性质、生物活性、应用及
16、安全性方面做一扼要论述，以便为下一步对卡拉胶致炎机理的研究提供一定的理论基础。关键词卡拉胶；应用；安全性；致炎作用1引言卡拉胶（也称鹿角藻胶或鹿角菜胶，英文名CARRAGEEN）是存在于海洋红藻纲的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等细胞壁中硫酸多糖1，2，因硫酸基团和内醚键位置不同，现已分为七种类型卡拉胶、和型3，其中、和卡拉胶的应用最为广泛4。它们具有独特的生物学性质，可以制成亲水胶体、凝胶、增稠、乳化、成膜、稳定分散剂等5，因此受到食品、日用化工和医药等行业的青睐6。近年来，我国已将卡拉胶列入食品添加剂目录，且它也已列入联合国粮农组织和世界卫生组织食用标准用量说明书，其应用前景非常广阔。
17、但是，对于卡拉胶使用的安全性，国内外存在着较大的争议。2卡拉胶的理化性质卡拉胶一般为白色或淡黄色，无臭、无味，呈半透明粒状或粉末状物7。另外，不同类型的卡拉胶在理化性质方面表现出一定的共性21黏性在较宽的PH范围内，所有的卡拉胶都为高粘度溶液，随着卡拉胶浓度的增大，它的粘度呈指数规律增大，分子量越大卡拉胶的粘度也越大8。22凝胶特性卡拉胶的浓度低至05，型卡拉胶形成具有微凝结能力的易碎的透明状凝胶体9，而型卡拉胶形成具有良好的凝结能力的柔软有弹性的凝胶体。根据PICULELL10的研究，型卡拉胶和型卡拉胶在冷却时即形成次序螺旋结构，其中型卡拉胶凝胶的次序螺旋结构是由两条平行和半交叉距离为26N
18、M的右旋三维螺旋链构成的同轴双螺旋结构，型卡拉胶凝胶的次序螺旋结构是距离为25NM的平行双螺旋结构，而型卡拉胶在冷却时不能形成凝胶。23可溶性所有的卡拉胶都能溶于热水和热牛奶，然而，在低温条件下，卡拉胶粉末在溶液中易结块，从而减慢了水合作用的速度，因此影响了溶液的粘度形成或凝胶强度11。加速卡拉胶水合速度的最好方法是利用水合作用即将卡拉胶和其他物质混合（如葡萄糖、蔗糖和盐类）并快速的搅拌12。3卡拉胶的生物活性卡拉胶属于天然硫酸多糖，是一类低毒的广谱抗病毒化合物。研究表明13，在体外，卡拉胶是人免疫缺陷病毒HIV、单纯疱疹病毒HSV、人巨噬细胞病毒、疱疹性口腔炎病毒、新培斯病毒等的有效抑制剂；
19、在体内，卡拉胶能诱导多形核嗜中性白细胞渗入腹膜腔，抑制从腹膜腔到血浆的病毒传播。近年来，卡拉胶的抗病毒研究集中于抗HIV和HSV的活性。研究结果显示，卡拉胶具有抗病毒作用，在一定条件下能抗艾滋病HIV1活性14，有望成为抗HIV和HSV的药物。科学家在对卡拉胶的研究中指出，饮食中适量的卡拉胶可加强先天免疫力，并可抵抗来自溶藻弧菌的感染15。4卡拉胶的应用情况41卡拉胶在食品工业中的应用卡拉胶广泛应用于乳制品、肉制品、酒类和软糖类等食品工业中，在这些食品工业中卡拉胶主要表现在具凝胶、增稠和蛋白反应性三个方面。411卡拉胶的蛋白反应作用溶液中的蛋白质聚集形成蛋白质胶束，卡拉胶游离在溶液中，和蛋白质
20、胶束的裸露氨基酸片断产生离子反应，根据浓度和PH的不同，分别发生凝聚沉淀、悬浮和胶凝16；而在肉制品固态中的蛋白质经过盐提取、热处理，蛋白质互相之间产生反应，形成蛋白质网状结构，卡拉胶能通过和蛋白质的互相作用加强这种结构。因此在蛋白质溶液中卡拉胶可以吸附蛋白质分子后，使蛋白溶液悬浮稳定17。412卡拉胶的凝胶作用PH95时，强度又回升。这是由于卡拉胶分子残基中存在交链扭结，使凝胶强度明显下降。适当浓度的OH在大分子中引入3,6脱水氧桥结构，有助于消除扭结，使分子链伸直，形成双螺旋结构，从而使凝胶强度增强18。413卡拉胶的增稠作用在实际应用中，弱凝胶卡拉胶的增稠作用一般用于冰淇淋和乳饮料中，结
21、合卡拉胶蛋白质体系产生的弱凝胶网络结构，加上钙盐等作用，可以赋予物料一定的稠度19。在冰淇淋中，卡拉胶加上甘露聚糖，赋予冰淇淋保型性，抗热变性，抑制冰晶长大，提高冰淇淋的膨胀率和融化率20。在乳饮料中卡拉胶一方面可起到增稠的作用，另一方面卡拉胶形成的弱凝胶并不会破坏其他物质产生的口感。42卡拉胶在非食品工业中的应用421应用于日用化工行业中包括彩条牙膏、润肤制品、洗涤剂等。以彩条牙膏为例，首先利用了卡拉胶优良的耐盐性和抗酶性，可有效提高膏体的稳定性；其次又利用卡拉胶非牛顿流体的特征，可明显提高膏体的触变性并改善膏体的成型性，从而很好地减少了彩条牙膏发生串色的几率21。422应用于医药领域中卡拉
22、胶独特的类肝素特点（硫酸多糖高分子），赋予了它和蛋白质绝无仅有的非专一性结合的反应性，产生了许多特殊的医药疗效，也使它们成为具有一定应用前景的候选药物。5卡拉胶的安全性研究进展通过以上所列举的一些卡拉胶的应用情况，可知卡拉胶工业的迅速发展，其食用安全性问题也在不断的受到国际机构的审视。卡拉胶是一种重要的食品添加剂22，其安全性使用范围备受关注。TOBACMAN等，对卡拉胶的安全性研究进行综述，表明卡拉胶能够诱导并促进肠道溃疡甚至癌变23。随后欧洲食品科学委员会（SCF）对TOBACMAN的报告进行了评价，认为没有证据显示食品级或其所含的降解卡拉胶对人有任何副作用。但是SCF认可分子量（MW）范
23、围应限制在510000的组分，旋转蒸发浓缩并冷冻干燥,得到14KDA的卡拉胶样品。312MW15D，在此期间每隔3D更换培养基。HE染色监测CACO2细胞呈膜的完整性。取处于指数生长期的THP1细胞悬液，调节密度为106细胞ML1，接种于24孔板中，每孔1ML，立即加入PMA（终浓度为01GML1）诱导36H，促使其分化为巨噬细胞；用PBS洗三次，换无血清RPMI1640培养基，继续培养12H，将已经形成完整细胞膜层的小室转移到此板中，模型建立完成的模拟如图2所示。图1培养CACO2细胞用的MILLICELL小室FIGURE1CACO2CELLSWERECULTUREDINTHEMILLICE
24、LL图2由CACO2细胞与THP1细胞构成的共培养模型。上层含有CACO2细胞的MILLICELL小室插入到下层培养THP1细胞的24孔板内。FIGURE2COCULTUREDMODELBYCACO2ANDTHP1CELLS,CULTUREDINTHEMILLICELLWHICHCULTURECACO2CELLSAPICALSIDEWERECHAMBEREDINTO24WELLPLATEWHICHCULTURETHP1CELLSBASOLATERALSIDE37ELISA检测卡拉胶刺激模型后细胞分泌IL8和TNF的变化用准备好的9种卡拉胶样品在低浓度下（10GML1）处理该共培养模型，同时设置
25、空白对照组（上、下层均有细胞但不加药处理）和阴性对照组（仅上层有细胞加药处理），再置于CO2培养箱继续培养24H。取该共培养模型各孔上、下层的上清，再用ELISA试剂盒检测THP1细胞分泌TNF因子的能力和CACO2细胞分泌IL8因子的能力。38统计学处理以上实验均重复做3次，所有数据以均值标准差（XS）表示。组间比较用T检验，以P005为显著差异。4结果41MTT法检测卡拉胶样品的细胞毒活性对9种样品的细胞毒性进行检测，结果发现，这9种卡拉胶样品的细胞毒活性在515GML1浓度范围内活性很低。当浓度为15GML1时，原、原、原、14KDA、14KDA、14KDA、5000、5000、5000
26、作用细胞存活率分别为（8825909）、（8919578）、（9437724）、（87161198）、（90931517）、（9173867）、（9451917）、（96111112）和（10241612）（结果如表1所示）。接下来，研究卡拉胶的致炎作用的药物浓度在此范围以内是否会直接对细胞产生损坏。表1不同浓度下卡拉胶的细胞毒活性TABLE1UNDERDIFFERENTCONCENTRATIONSOFCARRAGEENANSCYTOTOXIC存活率5GML110GML115GML1原9115807863512318825909原87171011897411098919578原91449279
27、096891943772414KDA897490391814898716119814KDA97391012818915679093151714KDA96041221929113449173867500092008299582815945191750009579718918715249611111250009335847100818611024161242卡拉胶对结肠上皮细胞分泌IL8的影响结果通过“方法”34和35的实验检测，确定是卡拉胶没有被LPS污染（数据略）。随后我们用9种卡拉胶样品在低浓度下（10GML1）处理阴性对照组的结肠上皮细胞CACO224H，结果发现，这9种卡拉胶都会影响CA
28、CO2细胞IL8的分泌，表明卡拉胶引起炎症反应没有结构效应。其中，14KDA作用后CACO2分泌的IL8与空白组相比增加了约18倍（结果如图3所示）。从结果可知，10GML1浓度的卡拉胶对CACO2分泌IL8的影响是有限的，没有使细胞分泌的IL8显著增加。050100150200250300CONTROL14KD14KD14KD500050005000CARRAGEENS10UG/MLIL8PG/ML图3不同卡拉胶对CACO2分泌IL8的影响FIGURE3DIFFERENTCARRAGEENANONCACO2SECRETIONOFIL843模型的建立情况肠上皮细胞之间有一种特殊的紧密连接，是相
29、邻上皮细胞间隙的松散连接，由多种功能各异的蛋白组成，该结构可以有效的阻止肠腔内细菌、毒素及炎性介质等物质的旁细胞转运。当肠上皮细胞之间相互连接形成紧密连接的生物屏障后，便可以有效发挥防御功能。在体外模拟肠上皮细胞屏障，即是建立一层紧密连接的细胞层。CACO2作为结肠上皮细胞，具有生长成为紧密连接的细胞层的能力。以半透膜作为基底，CACO2细胞附着生长，随机抽查细胞层完整性情况。到CACO2细胞生长到10D时，细胞层覆盖率达到70（如图4A、5A所示），生长到15D后，细胞层覆盖率为90以上（如图4B所示），生长到20D之后细胞层完全覆盖基底质形成完整肠上皮细胞屏障（如图5B所示）。此时细胞层具
30、有一定的屏障功能，保护下层物质阻挡外界刺激的作用。将已呈膜的CACO2细胞的小室转移到具有THP1细胞的孔板中，模型即建立成功，可以用于模拟卡拉胶刺激肠上皮细胞之后引起一系列细胞免疫响应的情况。图4HE染色监测CACO2细胞在MILLICELL小室中的呈膜情况（A，CACO2细胞在小室上培养10D已经覆盖70；B，CACO2细胞在小室上培养15D已经覆盖90以上）FIGURE4TOMONITORTHECASEOFCACO2CELLSPRESENTINGCHAMBERINMILLICELLBYHESTAININGA,THECHAMBEROFCACO2CELLSINTHESMALLROOMHASA
31、LREADYCOVERED70ONTHETRAIN10DB,THECHAMBEROFCACO2CELLSINTHESMALLROOMHASBEENCOVERED90ONTHETRAIN15D图5显微观察HE染色监测CACO2细胞在MILLICELL小室中的呈膜情况（A，CACO2细胞在小室上培养10D没有完全覆盖基底膜；B，CACO2细胞在小室上培养20D已经完全覆盖基底膜）FIGURE5TOMONITORTHECASEOFCACO2CELLSSTAINEDBYHEPRESENTINGCHAMBERINMILLICELLBYMICROSCOPEA,CACO2CELLSCULTUREDINASM
32、ALLROOMONTHE10DDIDNOTFULLYCOVERTHEBASEMENTMEMBRANEB,CACO2CELLSCULTUREDINASMALLROOMONTHE20DHAVECOMPLETELYCOVEREDTHEBASEMENTMEMBRANECACO2细胞层HE染色小室CACO2细胞层HE染色小室AB基底膜CACO2细胞层CACO2细胞层AB44卡拉胶刺激模型后细胞分泌IL8和TNF的变化及CACO2细胞膜层完整性检测结果低浓度的卡拉胶的细胞毒活性很低，不会对CACO2细胞产生直接的损伤。当以浓度为10GML1的卡拉胶样品直接刺激CACO2细胞（即阴性对照组）时，细胞分泌的I
33、L8改变不显著。但是，在模型中，以相同浓度10GML1的卡拉胶样品作用CACO2细胞层后，发现IL8分泌与对照组相比有显著的增加（结果如图6所示）。其中，当用5000刺激时细胞分泌的IL8与对照组相比增加高达50倍。模型中下层的THP1细胞分泌的TNF增幅没有IL8显著，其中5000作用时THP1细胞分泌的TNF与空白对照组相比增加了3倍（结果如图7所示）。同时，我们对CACO2细胞层的完整性进行检测发现，卡拉胶刺激过的模型中的CACO2细胞层被损坏，而对照组的CACO2细胞层保持较为完整（如图8所示）。图6不同卡拉胶（10GML1）刺激模型后对CACO2细胞分泌IL8的影响FIGURE6IL
34、8SECRETIONINCACO2CELLSAFTERDIFFERENTCARRAGEENAN10GML1STIMULATIONTHEMODEL05001000150020002500145000145000145000CARRAGEENS10UG/MLIL8PG/ML模型上层CACO2分泌的IL8对照组IL80500100015002000250030003500CONTROL145000145000145000CARRAGEENS10UG/MLTNFAPG/ML图7不同卡拉胶（10GML1）刺激模型后对THP1细胞分泌TNF的影响FIGURE7TNFSECRETIONINTHP1CELLS
35、AFTERDIFFERENTCARRAGEENAN10GML1STIMULATIONTHEMODEL图8不同卡拉胶（10GML1）刺激模型后对CACO2细胞层的损坏（A，卡拉胶刺激模型实验组；B，实验组模型小室上CACO2细胞层被严重损坏；C，空白对照组卡拉胶刺激后CACO2细胞层较为完整）FIGURE8THECASEOFCACO2CELLLAYERDAMAGEDAFTERDIFFERENTCARRAGEENAN10GML1STIMULATIONTHEMODELA,THEEXPERIMENTALGROUPMODELOFCARRAGEENANSTIMULATIONB,THECACO2CELLLA
36、YERWASSEVERELYDAMAGEDINTHESMALLROOMOFTHEEXPERIMENTALGROUPMODELC,THECACO2CELLOFBLANKCONTROLMAINTAINRELATIVELYCOMPLETEAFTERCARRAGEENANSTIMULATION5讨论细胞层破坏，细胞脱落空白对照组细胞层完整ABC卡拉胶具有多方面的活性，在药理学研究中被用作炎症模型的工具药。有较多的试验已经证明，动物长期口服降解或未降解的卡拉胶可引起肠黏膜损伤、溃疡性结肠炎和导致肿瘤发生，这些不良后果是相当严重的。由于卡拉胶目前仍然作为增稠剂和稳定剂在食品中应用极为广泛,如用于奶制品、布
37、丁、沙拉酱、果汁等，尤其是它们常常是儿童的主要食品，因此其安全性必须引起足够的重视。肠粘膜上皮细胞是组成肠道生物屏障的主要成员，它与粘膜上皮下方的结缔组织和固有层的支持组织，以及固有层中含有成纤维细胞、浆细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞及淋巴细胞等，共同组成屏障功能单位。本实验以结肠上皮细胞与巨噬细胞构建共培养模型研究卡拉胶致炎作用。研究结果发现，在低浓度下（10GML1）卡拉胶对结肠上皮细胞CACO2的细胞毒活性很低，单刺激结肠上皮细胞时对其IL8分泌的影响不显著。但是，当以同样的浓度10GML1卡拉胶作用于CACO2与THP1的共培养模型时，CACO2细胞分泌的IL8有显著的增加，从
38、几倍增到几十倍，THP1细胞分泌的TNF也有明显的增加。同时，我们发现当用卡拉胶处理共培养模型后，模拟肠上皮屏障的CACO2细胞层被损坏，而对照组细胞层则较为完整。引起相应实验现象的机理推测当卡拉胶刺激上层CACO2细胞后，导致IL8分泌增加，IL8被转运到下层，刺激THP1产生TNF，TNF可以促使上层的CACO2细胞发生凋亡，从而造成了CACO2细胞层的破坏，同时又再次刺激CACO2使细胞分泌IL8进一步的增加，从而引发免疫级联反应，最终导致从而导致炎症的产生。虽然，人体日常摄入的卡拉胶的量也是很有限的，但较长时间在体内没有代谢出去，在肠道存积，是具有引发肠道发生炎症反应的危险性。肠上皮细
39、胞作为肠道主要的生物屏障，在肠道防御中起着重要的作用。正常情况下，肠上皮细胞之间紧密连接通过调控作用，选择性地转运相应物质，而有效地阻止肠腔内细菌、毒素及炎性介质等物质的旁细胞转运，维持肠粘膜上皮屏障功能的完整。当肠上皮细胞被损坏，细菌等感染损伤处加剧炎症反应，低浓度的卡拉胶虽然不能直接对上皮细胞造成破坏，但是却能刺激细胞产生了免疫级联反应，最终引发肠道的炎症疾病。同时，由实验可知卡拉胶发挥致炎作用时不具有结构效应。民以食为天，食以安为先。近几年对于食品安全性的问题人们是越来越重视了，从三鹿奶粉到染色馒头，严重危害到人类的健康。卡拉胶作为常用的食品添加剂，且具有致炎作用及能引发肠道炎症疾病的潜
40、在危险性，其使用安全性的评估需要得到重视，希望有关部门对卡拉胶使用的安全性进行重新评估。参考文献1胡亚芹,竺美卡拉胶及其结构研究进展J海洋湖沼通报,2005,1951032周卫国,王文智卡拉胶的生产及应用C学术交流论文,2006,31621643孙远祥卡拉胶的应用J安徽科技,2000,538394刘芳,赵谋明,徐建祥等不同原料卡拉胶的物性比较研究C华南理工大学学报自然科学版,2001,559635宁发子,何新益,殷七荣等卡拉胶的特性与食品应用J食品科技,2002,336386袁华茂卡拉胶寡糖与衍生物的制备及生物活性研究C中国科学院海洋研究所,博士论文,20057徐强,管华诗卡拉胶研究的发展及现
41、状J青岛海洋大学学报,1995,S11171248中华人民共和国国家标准食品添加剂一卡拉胶M北京中国标准出版社,19949黄来发食品增稠剂M北京中国轻工业出版社,2000,70838410胡坤,赵谋明物理作用力对卡拉胶凝胶体质构特性影响的研究J食品与发酵工业,2003,2565811浮吟梅,王林山卡拉胶在食品工业中的应用A开发应用中国食品添加剂,2009,416016212吴剑锋,吴晖,吴涛几种亲水性胶体凝胶特性研究J广州食品工业科技,2004,44613胡茵,黄宏光,韦曲颖卡拉胶在彩条牙膏中的试验与研究J牙膏工业,2006,1323414陶慧娜,孙涛卡拉胶及其衍生物的生物活性研究进展A安徽农
42、业学,2008,197967796815王长云,管华诗多糖抗病毒作用研究进展卡拉胶及其抗病毒作用J生物工程进展,2000,3394216CHENGAC,CHENYY,CHENJCDIETARYADMINISRATIONOFSODIUMALGINATEANDKEAMAGEENANENHANCESTHEINNATEIMMUNERESPONSEOFBROWNMARBLEDGROUPEREPINEPHELUSFUSCOGUTTATUSANDRESISTANCEAGAINSTVIBRIOALGINOLYTICUSAVETERINARYIMMUNOLOGYANDIMMUNOPATHOLOGY,2008,1
43、2120621517TOBACMANJKTOXICCONSIDERATIONSRELATEDTOINGESTIONOFCARRAGEENANINPREEDY,VRANDWATSON,RR,EDITORSREVIEWSINFOODANDNUTRITIONTOXICITYAVOL1NEWYORKTAYLORFRANCIS,2003,P20422918JAYSEKHARP,RAOSB,SANTHAKUMARIGEFFECTOF5SUBSTITUTEDBENZYLIDENEAMINOSALICYLICACIDONCGNINDUCEDULCERATIVECOLITISJBOLLCHIMFARM,2004
44、,14330931319MARRSWMTHESTABILITYOFCARRAGEENANTOPROCESSINGINWILLIAMSPA,PHILLIPSGO,EDITORSGUMSANDSTABILIZERSFORTHEFOODINDUSTRYCCAMBRIDGEUJTHEROYALSOCIETYOFCHEMISTRY,1998,P34535720WILCOXDK,HIGGINSJ,BERTRAMTACOLONICEPITHELIALCELLPROLIFERATIONINARATMODELOFNONGENOTOXININDUCEDCOLONICNEOPLASIACLABINVEST,1992
45、,6740541121CALVERTRJ,REICKSMALTERATIONSINCOLONICTHYMIDINEKINASEENZYMEACTIVITYINDUCEDBYCONSUMPTIONOFVARIOUSDIETARYFIBERSMPROCSOCEXPBIOLMED,1988,189455122ARAKAWAS,OKUMUAM,YAMADAS,ETALENHANCINGEFFECTOFCARRAGEENANONTHEINDUCTIONOFRATCOLONICTUMORSBY1,2DIMETHYLHYDRAZINEANDITSRELATIONTOGLUCURONIDASEACTIVITI
46、ESINFECESANDOTHERTISSUESJNUTRSCIVITAMINOLTOKYO,1986,3248148523SCHEPETKINIA,QUINNMTBOTANICALPOLYSACCHARIDESMACROPHAGEIMMUNOMODULATIONANDTHERAPEUTICPOTENTIALMINTERNATIONALIMMUNOPHARMACOLOGY,2006,0631733324TOBACMANJKREVIEWOFHARMFULGASTROINTESTINALEFFECTSOFCARRAGEENANINANIMALEXPERIMENTSJENVIRONHEALTHPER
47、SPECT,2001,10998399425SUMITB,ALIPB,PRADEEPK,ETALCARRAGEENANINDUCESCELLCYCLEARRESTINHUMANINTESTINALEPITHELIALCELLSINVITROJTHEJOURNALOFNUTRITION,2009,1546947526KITSUKAWAY,SAITOH,SUZUKIY,ETALEFFECTOFINGESTIONOFEICOSAPENTAENOICACIDETHYLESTERONCARRAGEENANINDUCEDCOLITISINGUINEAPIGSMGASTROENTEROLOGY,1992,1
48、021859186627ZHOUGF,XINH,SHENGWX,ETALINVIVOGROWTHINHIBITIONOFS180TUMORBYMIXTUREOF5FUANDLOWMOLECULARCARRAGEENANFROMCHONDRUSOCELLATUSJPHARMACOLOGICALRESEARCH,2005,5115315728陈海敏,严小军,王峰等不同聚合度的卡拉胶降解物对人结肠上皮细胞的影响J中国食品学报,2009,1899329TAKESHIT,YOSUKEN,KAZUKIK,ETALINVITROMODELTOESTIMATEGUTINAMMATIONUSINGCOCULTU
49、REDCACO2ANDRAW2647CELLSABIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIONS,2008,37456556930NINUSCL,LARSOLOFSUNDELOFETALPREPARATIVESEPARATIONOFOLIGOSACHARIDESFROMCARRAGEENAN,SODIUMHYALURONATE,ANDDEXTRANBYSUPERDEXTM30PREPJGRADECARBOHYRES1995,273717631ALISTAIRPENMAN,DAVIDARCARRAGEENANSXIMILDOXIDATIONHYDROLYSISOFANDCARRAGEENANSANDTHECHARACTERIZATIONOFOLIGASACCHARIDESULFATESCJCS,PERKINI,1973,2191219632T
